HSP70-CD80嵌合DNA疫苗通過(guò)調(diào)節(jié)趨化因子及受體對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥干預(yù)作用及機(jī)制的研究.pdf

1、目的:支氣管哮喘(哮喘)是一種復(fù)雜的氣道慢性炎癥疾病,其主要病理特點(diǎn)是氣道嚴(yán)重炎癥反應(yīng),氣道高反應(yīng)性(airway hyperreactivity AHR)和氣道重塑,發(fā)病過(guò)程中涉及多種炎癥介質(zhì)和免疫細(xì)胞對(duì)氣道的作用。T淋巴細(xì)胞從輔助性T細(xì)胞(Th細(xì)胞)產(chǎn)生的細(xì)胞因子類型分為Th1、Th2型,而Th1/Th2失衡是哮喘最重要的發(fā)病機(jī)制。而對(duì)這些炎癥細(xì)胞的活化和向氣道遷移的過(guò)程中,趨化因子則起著重要作用。本實(shí)驗(yàn)意在討論是否可以通過(guò)調(diào)節(jié)哮喘

2、發(fā)病過(guò)程中趨化因子及趨化因子受體來(lái)平衡Th1、Th2反應(yīng),以達(dá)到治療哮喘的目的。DNA疫苗是一種新型疫苗,具有安全、熱穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn),近年來(lái)已在哮喘的防治研究中取得了初步成果。Th1反應(yīng)加強(qiáng),Th2反應(yīng)受到抑制,達(dá)到Th1/Th2免疫平衡狀態(tài)并發(fā)揮對(duì)結(jié)核桿菌的抑制和殺滅作用。研究HSP70/CD80嵌合疫苗對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性以及TARC及其受體CCR4在肺組織中表達(dá)情況的影響,并探討IL-4、CCR4、TARC在哮喘氣道炎

3、癥中的作用及其對(duì)Th2細(xì)胞選擇性調(diào)節(jié)的機(jī)制。哮喘現(xiàn)在已經(jīng)成為危害人類健康的一大殺手,積極的治療措施是應(yīng)該有的態(tài)度。在現(xiàn)在哮喘預(yù)防和治療的措施中,藥物治療的方法如激素的治療存在著許多副作用。而傳統(tǒng)的方法不能治病求本,不能從根本上解決問(wèn)題,只能有限地改善癥狀。這些方法現(xiàn)都不能完全治療哮喘?，F(xiàn)如今的研究中對(duì)免疫疫苗的治療方法已經(jīng)有了初步的研究,并取得了一定的成果。哮喘的本質(zhì)主要是免疫反應(yīng)失去了平衡,從而亢進(jìn)的一方分泌多種細(xì)胞因子使炎癥介質(zhì)和炎

4、癥細(xì)胞從外周血液遷移到發(fā)生炎癥的部位,沉積在氣道膠原纖維中發(fā)生一系列免疫反應(yīng)。其中包括相應(yīng)的趨化因子及趨化因子受體結(jié)合產(chǎn)生離子通道開(kāi)放,離子外流引起細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境失調(diào),導(dǎo)致氣道分泌大量粘液,阻塞氣道,患者出現(xiàn)呼吸困難,流鼻涕,心累等癥狀。所以應(yīng)用免疫治療的方法抑制亢進(jìn)的一方反應(yīng),加強(qiáng)被抑制的一方,從而使得恢復(fù)免疫平衡狀態(tài),打斷上訴一系列反應(yīng)鏈,重新使身體機(jī)能復(fù)原。那么怎么樣來(lái)使用免疫方法呢?免疫疫苗有很多的優(yōu)點(diǎn),它進(jìn)入體內(nèi)后可以通過(guò)抗原提

5、成的作用使得TH1反應(yīng)加強(qiáng)從而使得另一方收到抑制。沒(méi)有副作用,因?yàn)槠浔举|(zhì)是增強(qiáng)自身的免疫力,使得免疫內(nèi)環(huán)境達(dá)到平衡?，F(xiàn)在研究的核酸DNA疫苗就是其中的一種。也是最熱門的一類。本實(shí)驗(yàn)也是應(yīng)用處理過(guò)的核酸DNA疫苗給小鼠注射,然后測(cè)量小鼠的各類指標(biāo)如:IgE,TACR,IL-4,CCR4等相關(guān)的細(xì)胞因子及趨化因子,發(fā)現(xiàn)這些導(dǎo)致氣道炎癥反應(yīng)和氣道高反應(yīng)性的炎癥介質(zhì)和因子都明顯地下降,疫苗組小鼠出現(xiàn)的相應(yīng)的哮喘癥狀也減輕,甚至是消失。這個(gè)實(shí)驗(yàn)證

6、實(shí)了核酸疫苗的治療方法是確實(shí)有效的。為臨床研究奠定了基礎(chǔ)。
　　方法:鑒定HSP70/CD80嵌合DNA真核表達(dá)質(zhì)粒,制備pVAX1質(zhì)粒和HSP70/CD80嵌合質(zhì)粒.對(duì)照組、哮喘組、pVAX1載體組和HSP70/CD80嵌合DNA疫苗組。載體組和疫苗組分別腹腔注射pVAX1質(zhì)粒和HSP70/CD80嵌合質(zhì)粒,對(duì)照組與哮喘組注射相同劑量的生理鹽水。眼球采血用ELISA方法檢測(cè)外周血中IgE的含量。光鏡下觀察小鼠肺組織病理變化。免疫

7、組織化學(xué)TARC抗原,定位其來(lái)源和在氣道中的表達(dá)情況。Real-Time PCR檢測(cè)肺組織IL-4和CCR4基因的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.小鼠氣道反應(yīng)性:予以不同濃度AchE刺激后,與對(duì)照組相比,哮喘組和載體組小鼠的氣道反應(yīng)性明顯增高,而疫苗組有所降低。在AchE濃度達(dá)24mg/ml后,哮喘組、載體組小鼠顯著高于對(duì)照組(P<0.050),而疫苗組小鼠低于哮喘組開(kāi)始有明顯差異,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.050)。

8、>　　2.肺組織病理學(xué)改變:在小鼠肺 HE染色的病理切片中,哮喘組和載體組其支氣管和血管周圍甚至肺泡有明顯的炎細(xì)胞浸潤(rùn),支氣管上皮有斷裂、壞死,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.050);而疫苗組能有效抑制氣道和血管周圍的炎癥反應(yīng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.050);在小鼠肺切片PAS染色中,哮喘組和載體組氣道上皮中杯狀細(xì)胞增生肥大, PAS著色細(xì)胞明顯增加,管腔中有大量黏液形成。
　　3.血清中IgE濃度變化:與對(duì)照組比較,哮喘組和載體

9、組小鼠血清中IgE含量明顯升高(P<0.050);與哮喘組相比,疫苗組血清中IgE含量降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.050)。
　　4.免疫組化檢測(cè)肺組織TARC蛋白表達(dá)情況:免疫組化顯示TARC蛋白主要表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞,哮喘組和載體組 TARC表達(dá)明顯增多呈陽(yáng)性或強(qiáng)陽(yáng)性(P<0.050),與哮喘組比較,疫苗組 TARC表達(dá)呈陰性或弱陽(yáng)性,差異學(xué)有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.050)。
　　5.Real-Time PCR法檢測(cè)

10、肺組織IL-4、CCR4的基因表達(dá)水平:與對(duì)照組比較,哮喘組和載體組IL-4、CCR4的基因表達(dá)增加(P<0.050);與哮喘組相比,
　　6.相關(guān)性分析:小鼠免疫組化半定量TARC與肺組織炎細(xì)胞呈正相關(guān)(r=0.661,P<0.010);小鼠免疫組化半定量 TARC與肺組織 IL-4呈正相關(guān)(r=0.573,P<0.050);小鼠免疫組化半定量 TARC與肺組織CCR4呈正相關(guān):(r=0.706,P<0.050);小鼠肺組織IL

11、-4與CCR4相呈正相關(guān):(r=0.536,P<0.050)。
　　結(jié)論:
　　1,為該質(zhì)粒在動(dòng)物體內(nèi)的免疫學(xué)效應(yīng)進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。
　　2.HSP70/CD80嵌合DNA疫苗可減輕氣道炎癥反應(yīng),減少黏液分泌,降低氣道阻力。
　　3.本研究結(jié)果顯示HSP70/CD80嵌合DNA疫苗可通過(guò)抑制TARC在上皮細(xì)胞的表達(dá),從而打斷了IL-4,TARC正反饋效應(yīng),減弱Th2反應(yīng),為該疫苗作為新型免疫調(diào)節(jié)性疫苗提供新的