HSP70-CD80嵌合DNA疫苗對哮喘小鼠氣道重塑的干預(yù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的:哮喘是由多種炎癥細(xì)胞共同作用的結(jié)果。其中氣道重塑(airwayremodeling)是支氣管哮喘的重要病理學(xué)特征。研究哮喘氣道重塑機(jī)制,并給予干預(yù)是目前治療哮喘的重要領(lǐng)域。在本研究中,以雞卵清蛋白(ovalbumin,OVA)致敏小鼠作為模型,觀察HSP70／CD80嵌合DNA疫苗對哮喘小鼠氣道重塑的干預(yù)作用,并探討其可能的作用機(jī)制,為臨床哮喘病的治療提供實驗依據(jù),期望獲得更安全、免疫原性更強的新型免疫調(diào)節(jié)性疫苗。
　　

2、方法:PCR鑒定HSP70／CD80嵌合DNA真核表達(dá)質(zhì)粒,大量提取pVAX1質(zhì)粒和HSP70／CD80嵌合DNA質(zhì)粒。并用核酸定量儀測定所提質(zhì)粒濃度和純度,將質(zhì)粒溶于生理鹽水中稀釋備用。將40只雌性健康BALB／c小鼠隨機(jī)分成4組:空白對照組、哮喘模型組、pVAX1載體組和HSP70／CD80嵌合DNA疫苗組,每組10只。利用OVA經(jīng)腹腔注射致敏然后OVA霧化激發(fā)哮喘建立哮喘模型,空白對照組以生理鹽水代替。哮喘模型建立后載體組和疫苗組

3、小鼠分別肌肉注射pVAX1質(zhì)粒和HSP70／CD80嵌合質(zhì)粒,空白對照組和哮喘模型組以生理鹽水代替。在最后一次OVA霧化后24 h,眼球采血收集外周血血清,麻醉后收集支氣管肺泡灌洗液,用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbentassy,ELISA)檢測支氣管肺泡灌洗液(broncho alveolar lavage fluid,BALF)中白細(xì)胞介素-5(interleukin-5,IL-5)和外周血中Ig

4、E的濃度,常規(guī)蘇木素-伊紅(hamatoxylin-eosin,HE)染色觀察小鼠肺組織炎癥情況及氣道重塑病理形態(tài)學(xué)改變；阿辛藍(lán)-過碘酸雪夫(alcian blue periodicacid-schiff,AB-PAS)染色觀察杯狀細(xì)胞增生和黏液分泌情況；Masson三色染色觀察氣道壁膠原沉積；免疫組織化學(xué)增殖細(xì)胞核抗原(proliferatingcell nuclear antigen,PCNA)染色觀察氣道平滑肌增生情況；Real-

5、Time PCR.檢測T-bet及GATA-3基因在脾臟組織中的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:1.和空白對照組相比,哮喘模型組和載體組小鼠氣道和血管及肺組織周圍炎癥反應(yīng)明顯,血清中IgE濃度明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；和哮喘模型組相比,DNA疫苗組能減輕炎癥,降低血清中IgE濃度,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。2.和空白對照組相比,哮喘模型組和載體組小鼠氣道壁增厚,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；和哮喘模型組相比

6、,DNA疫苗組小鼠氣道壁減薄,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。3.和空白對照組相比,哮喘模型組和載體組支氣管上皮中AB-PAS染色陽性的杯狀細(xì)胞增多,粘液分泌增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；和哮喘模型組相比,DNA疫苗組能抑制杯狀細(xì)胞的增生,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。4.哮喘模型組和載體組氣道上皮下藍(lán)色的膠原纖維增厚明顯；空白對照組和DNA疫苗組上皮下含有少量藍(lán)色的膠原纖維沉積。5.和空白對照組相比,哮喘模型組和載體組

7、支氣管上皮下肌層增生明顯,總平滑肌細(xì)胞數(shù)和PCNA陽性表達(dá)的平滑肌細(xì)胞數(shù)明顯增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；和哮喘模型組相比,DNA疫苗組能有效抑制平滑肌細(xì)胞數(shù)的增生,總平滑肌細(xì)胞和PCNA陽性的平滑肌細(xì)胞數(shù)減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。6.和空白對照組相比,哮喘模型組和載體組BALF中的IL-5濃度增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);和哮喘模型組相比,HSP70／CD80嵌合DNA疫苗組能減少BALF中IL-5濃

8、度,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。7.和哮喘模型組相比,DNA疫苗組T-bet表達(dá)及T-bet／GATA-3比值升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論:1.哮喘模型組小鼠血清IgE增高,氣道壁膠原纖維增厚,杯狀細(xì)胞增生,平滑肌細(xì)胞增殖,這些都是氣道重塑的典型改變。2.HSP70／CD80嵌合DNA質(zhì)粒鑒定結(jié)果與預(yù)期相符。3.HSP70／CD80嵌合DNA疫苗可減輕氣道黏液分泌、上皮下膠原纖維沉積、平滑肌細(xì)胞及杯