小分子胞漿核糖核蛋白SSA-Ro、SSB-La基因的克隆、Ro60KD蛋白的重組表達(dá)及臨床意義初步探討.pdf

1、自身免疫性疾病實(shí)驗(yàn)診斷的主要指標(biāo)之一是自身抗體的檢測(cè)<'[3]>,血清中抗SSA/Ro、SSB/La抗體在臨床診斷上有重要參考價(jià)值,在原發(fā)性干燥綜合征(pSS)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、亞急性皮膚型狼瘡(SCLE)、新生兒狼瘡(NLE)等病人的血清中陽(yáng)性率較高<'[4]>,它們?cè)诎l(fā)病機(jī)制中的作用尚不清楚.目前,由于抗原來(lái)源和檢測(cè)方法的限制,國(guó)內(nèi)尚無(wú)ELISA方法檢測(cè)ENA試劑盒問(wèn)世,為了給開(kāi)發(fā)該項(xiàng)目打基礎(chǔ),本研究利用基因工程技術(shù),克隆

2、了SSA/Ro、SSB/La基因,表達(dá)了Ro60KD重組蛋白,建立ELISA方法,檢測(cè)了風(fēng)濕病患者血清中抗60KD抗體,并進(jìn)行了臨床意義初步探討.首先從Hela細(xì)胞提取總RNA,應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增cDNA,再以此為模板作PCR,將PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體PET-30a酶切后進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,堿裂解法進(jìn)行質(zhì)粒小量制備,通過(guò)酶切鑒定和PCR擴(kuò)增鑒定,并經(jīng)測(cè)序證實(shí)為SSA/Ro52KD、60KD、SSB/La編碼序列.表達(dá)載體

3、構(gòu)建成功后,在大腸桿菌BL21(DE3)plysS中獲得了高效表達(dá),產(chǎn)生重組融合蛋白.利用金屬螯合親和層析法進(jìn)行純化,得到了高純度的、具有Ro抗原活性的重組蛋白,達(dá)到ELISA檢測(cè)要求,為制備重組抗原用于臨床檢測(cè)奠定了基礎(chǔ).以重組蛋白為抗原,建立ELISA方法,檢測(cè)了臨床標(biāo)本336例,其中pSS124例、SLE104例、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)36例、系統(tǒng)性硬化癥(SSc)20例、混合性結(jié)締組織病(MCTD)12例、健康人40例,比較抗Ro