核不均一核糖核蛋白L在人腎透明細胞癌組織中表達及其臨床意義.pdf

1、背景與目的:腎細胞癌是起源于腎實質泌尿小管上皮細胞的惡性腫瘤，是泌尿系統(tǒng)中惡性度較高的腫瘤，也是最常見的腫瘤之一，占腎臟原發(fā)性腫瘤的85％-90％，其中80％-90％為透明細胞癌(Clear Cell Renal Cell Carcinoma)，并且其發(fā)病率近年來呈上升趨勢。由于腎透明細胞癌的發(fā)病機制尚不清楚，其早期臨床表現(xiàn)常不典型，故有近一半的患者在發(fā)現(xiàn)時已處于腎癌晚期或發(fā)生遠處轉移而喪失手術機會。同時腎癌對放療和化療均不敏感;而免疫

2、治療的療效有限，故其最主要治療方法是手術切除術，但術后復發(fā)率達25％-50％?？偟膩碚f，藥物和手術對于腎細胞癌患者無進展生存期和總生存率依然不盡人意。缺乏特異性分子標記物和有效地治療靶點是目前腎癌診治過程中所面臨的難題和關鍵。因此，腎透明細胞癌臨床診斷方式的突破及治療方法的改善有賴于基礎研究的重大進展，有賴于對腎透明細胞癌發(fā)生機制的闡明。
　　越來越多的證據(jù)表明，RNA的選擇性剪接作為一個廣泛存在的生物進程，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程

3、中發(fā)揮重要作用。其中，核不均一核糖核蛋白家族(hnRNPs)因具有選擇性剪接作用而在腫瘤發(fā)生中占據(jù)重要位置。核不均一核糖核蛋白L（hnRNP L）作為hnRNPs家族中的一員，近幾年在腫瘤中的研究相繼開展，但是有關hnRNPL在腎透明細胞癌中的表達情況及其功能調控機制研究在國內外尚無公開報道。核內不均一核糖核蛋白(heterogeneous nuclearribonucleoprotein，hnRNP)是存在于細胞核中的一類RNA結合蛋

4、白，到目前為止已發(fā)現(xiàn)大約20多種hnRNPs(A～U)蛋白，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種hnRNPs蛋白在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。核不均一蛋白L(hnRNP L)是由pifiol.RomaS[21]等在早期轉錄片段中發(fā)現(xiàn)的富含胱氨酸及脯氨酸的核糖核蛋白，是核不均一核糖核蛋白（核蛋白）復合體的一個重要組成部分。HnRNP L作為RNA結合蛋白，參與染色體重塑、轉錄、翻譯的調控以及信號轉導過程，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用越來越引起重視。已有的生物信息

5、學分析也顯示hnRNPL與hnRNPs家族數(shù)個成員是功能伴侶(function partner)，Pubgene分析提示hnRNPL與細胞的凋亡、死亡和生長等生物學進程密切相關。近年來相繼有hnRNPL在腫瘤中的研究報道，證實hnRNPL可能通過影響mRNA前體剪接參與肝癌、肺癌、轉移性結直腸癌和食管鱗狀細胞癌等腫瘤發(fā)生，但其分子機制及可能涉及的信號通路尚未完全清楚。從已發(fā)表的文獻中未見hnRNPL在腎透明細胞癌中的作用機制研究，但是h

6、nRNPL在其他相關領域中的機制研究已有報道。它可能通過以下機制起作用:1.mRNA前體剪接作用:hnRNPL通過與caspase-9前體mRNA結合調控肺癌細胞的侵襲力;同時hnRNPL也參與CEACAM1(癌胚抗原相關細胞黏附分子1)前體mRNA的選擇性剪接;2.受IRES(內部核糖體進入位點序列)調節(jié):IRES為非編碼RNA，折疊成類似于起始tRNA的結構，從而介導核糖體與RNA結合，起始蛋白質翻譯。有文獻報道，hnRNP L發(fā)揮

7、作用依賴于HCV-IRES活性;3.逆轉錄調控:hnRNPL可以作為主要影響因素通過結合LINE-1（長分散元件）RNA參與逆轉錄調控;4.與miRNA相互作用:Jafarifar等發(fā)現(xiàn)有4種短鏈非編碼RNA(miRNA)結合在VEGFA（血管內皮生長因子）3'-非編碼區(qū)的順式作用元件上，而hnRNPL同樣結合于此區(qū)域，并且可以抑制miRNA的沉默作用。近期有研究表明:lncRNA-THRIL和hnRNP L形成的功能復合體可以與TNF

8、α啟動子區(qū)域結合，通過調節(jié)Toll受體信號通路中的髓樣分化因子MyD88，達到調控TNFα基因轉錄的作用。該研究提示lncRNA及其結合蛋白在人類先天性免疫缺陷以及感染的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類轉錄本長度超過200nt、不編碼蛋白的RNA。lncRNA起初被認為是基因組轉錄的“噪音”，不具有生物學功能。然而，近年來的研究表明lncRNA能在表觀遺傳、轉錄及轉錄后水

9、平上調控基因表達，參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸?shù)榷喾N重要的調控過程，與人類疾病的發(fā)生、發(fā)展和防治都有著密切聯(lián)系。雖然近年來關于lncRNA的研究進展迅猛，但是絕大部分的lncRNA的功能仍然是不清楚的。隨著研究的推進，各類lncRNA的大量發(fā)現(xiàn)，lncRNA的研究已經(jīng)成為RNA研究的新領域。
　　HnRNP L與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系已明確，然而到目前為止，其在腎透明細胞癌中的發(fā)生發(fā)展中的

10、功能及其分子調控機制仍存在許多待闡明的重要問題。HnRNP L參與的信號通路至今尚不清楚;闡明hnRNPL基因的表達調控機制是明確其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中作用的重要基礎。本研究的開展有助于發(fā)現(xiàn)腎細胞癌致病機理;為臨床腎透明細胞癌的早期診斷、治療及預后判斷提供新的分子標志物。
　　方法:(1)每例腎透明細胞癌切取約3mm×5mm大小組織，取材后立即置入凍存管中，放入液氮中保存。根據(jù)病理診斷結果初步分為腎透明細胞癌組和正常腎臟組織組。免疫組

11、化檢測兩組樣本中hnRNP L的表達強度。染色表達評分方法根據(jù)染色強度和陽性細胞數(shù)比例兩項指標進行綜合評判。應用Western blot驗證hnRNP L蛋白在腎透明細胞癌組織和癌旁非腫瘤組織中的表達。然后應用統(tǒng)計學分析hnRNP L表達與患者臨床參數(shù)（包括:年齡、性別、腫瘤體積、TNM分期、病理分期、組織學分級等）與之間的相關性。
　　(2)HnRNP L蛋白在腎透明細胞癌中的表達與患者預后的關系，Kaplan-Meier法分析

12、hnRNPL表達同患者生存時間之間的關系。此外，我們對hnRNPL檢測的敏感度及特異度進行統(tǒng)計學分析，判定其是否可作為腎透明細胞癌診斷的分子標記物。
　　(3)課題組另外成員已開始研究hnRNP L的功能，本人前期通過采用
　　Arraystar Human LncRNA Microarray V3.0芯片，比較了敲低hnRNP L的腎癌SN12-PM6細胞與對照細胞lncRNA及mRNA的基因表達譜差異，初步分析hnRNP

13、L在腎透明細胞癌中的可能調控機制。
　　結果:(1) HnRNP L蛋白在90例腎透明細胞癌組織和癌旁非腫瘤組織中的表達有差異，在腫瘤中為低表達，hnRNPL蛋白主要表達于細胞核內，呈彌漫性分布。HnRNP L蛋白在腎透明細胞癌組織中陽性表達率為71.1％(64/90);在腎透明細胞癌組織中hnRNPL蛋白顯色的陽性細胞數(shù)及顯色強度較癌旁非腫瘤組織明顯減少，在少數(shù)癌旁非腫瘤組織中呈陰性表達，陽性表達率為98.9％(89/90)，兩

14、者比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);
　　(2)90例腎透明細胞癌患者組織中，hnRNPL蛋白的表達與T分期、組織分級、臨床分期及腫瘤大小密切相關;其中，T1a、T1b和T2-T3期hnRNPL蛋白的陽性表達率分別為88.9％(32/36)、76.7％(23/30)和37.5％(9/24)，組間比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。組織學分級為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ患者中，hnRNP L蛋白的陽性表達率分別為80.9％(38/47)

15、、53.6％(15/28)和73.3％(11/15)，組間比較，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。臨床分期為1期和2期患者中，hnRNPL蛋白的陽性表達率分別為83.1％(54/65)和40.0％(10/25)，組間比較，差異具有統(tǒng)計學意義妒＜0.05)。腫瘤大小中(≤178，＞178)，hnRNPL蛋白的陽性表達率分別為82.0％(50/61)和48.3％(14/29)，組間比較差異有顯著性(P＜0.05）。然而，hnRNPL蛋白表

16、達與患者年齡無明顯相關性;
　　(3) Kaplan-Meier法分析顯示hnRNPL低表達患者的生存時間顯著低于其高表達患者，hnRNPL低表達患者總生存時間(37.75±4.904)較短，hnRNP L高表達患者總生存時間(68.483±3.286)較長，差異具有統(tǒng)計學意義(LogRank=30.18，P=0.000)（粗線代表hnRNP L低表達組;虛線代表hnRNPL高表達組）。HnRNP L陽性組患者5年生存率75.0％

17、(95％ CI,64.024％,85.976％)，然而hnRNP L陰性患者的5年生存率僅有20.8％(95％CI,4.532％,37.068％);對腫瘤體積小于178cm3的患者生存時間數(shù)據(jù)分析顯示在小體積腎癌中hnRNP L的差異表達患者生存時間也會產(chǎn)生顯著差異(P＜0.001);對組織學分級在Ⅰ期的患者生存時間數(shù)據(jù)分析顯示Ⅰ期的早期腎癌中hnRNPL的差異表達患者生存時間也會產(chǎn)生顯著差異(P＜0.001);組織學分級在Ⅱ-Ⅲ期的患

18、者同樣有顯著差異(P=0.007)。
　　結論:(1)HnRNP L蛋白在人腎透明細胞癌中的表達水平顯著低于癌旁非腫瘤組織，且與腎透明細胞癌病理參數(shù)呈負相關，其表達水平的下降提示患者更差的預后;
　　(2) HnRNP L可能作為腎透明細胞癌患者預后的獨立危險因素;
　　(3) HnRNP L與腎透明細胞癌發(fā)生存在聯(lián)系，其可能作為腎透明細胞癌患者早期診斷和預后評估的分子標志物。
　　(4) HnRNP L可能通過