一種分離正常成年大鼠肝臟祖細(xì)胞新方法的研究.pdf

1、研究背景:
　　 急性肝衰竭是一種可以由各種急性或慢性肝病引起的少見(jiàn)但致命的疾病。目前肝移植被認(rèn)為是終末期肝病患者重要的治療方法。然而,肝移植的可行性受到成本高、供體器官短缺、手術(shù)技術(shù)要求高、需要服用免疫抑制劑等因素的限制。由于各種肝衰竭多由肝功能紊亂所致,而肝細(xì)胞或肝細(xì)胞樣細(xì)胞移植后可發(fā)揮正常功能,因此,肝細(xì)胞或肝細(xì)胞樣細(xì)胞移植是急性和慢性肝功能衰竭很有前途的替代療法之一。不過(guò)這種療法同樣受到供體細(xì)胞的缺乏和免疫排異的限制。肝

2、干／祖細(xì)胞有良好的增殖潛能,且有較低的免疫源性,有可能用于細(xì)胞移植以取代肝移植治療終末期肝病。因此,對(duì)諸如成熟細(xì)胞或干／祖細(xì)胞的移植以及移植異種器官的研究方興未艾。大量研究表明肝干／祖細(xì)胞存在于成年嚙齒類(lèi)動(dòng)物和成人的肝臟中,這群細(xì)胞共表達(dá)肝細(xì)胞和干細(xì)胞的表面標(biāo)志。然而,目前研究認(rèn)為在正常成年肝臟中,肝干／祖細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài),僅有少量肝干／祖細(xì)胞出現(xiàn)于匯管區(qū),且只有受到嚴(yán)重創(chuàng)傷時(shí)才會(huì)出現(xiàn)肝干／祖細(xì)胞的增殖。最近,不少有關(guān)肝衰竭模型的研究指

3、出,從這些模型中可以分離出大量的肝干／祖細(xì)胞,如二乙基亞硝胺模型大鼠、2-AAF／肝切模型大鼠以及倒千里光堿／肝切模型大鼠。盡管應(yīng)用的化學(xué)試劑多種多樣,但這些實(shí)驗(yàn)方法的目的都是為了使造模動(dòng)物產(chǎn)生嚴(yán)重、持續(xù)的肝損傷。雖然從這些疾病模型動(dòng)物中可以分離出大量的肝干／祖細(xì)胞,但這些細(xì)胞都來(lái)自于異常個(gè)體。有假說(shuō)稱(chēng)在整個(gè)肝癌的發(fā)展過(guò)程中,肝干／祖細(xì)胞發(fā)揮重要的作用。那么即使大量的肝干／祖細(xì)胞可以分離自肝臟,但細(xì)胞的品質(zhì)無(wú)法得到保證。目前為止,尚無(wú)一

4、種好的實(shí)驗(yàn)方法能夠獲得大量的純度高、活性好的肝干／祖細(xì)胞,肝干／祖細(xì)胞體外分離、純化、鑒定、體外培養(yǎng)技術(shù)有待于進(jìn)一步完備,這些因素都是制約肝干／祖細(xì)胞臨床應(yīng)用的瓶頸。
　　 研究目的:
　　 利用正常肝臟探索建立一套肝干／祖細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定的新方法。
　　 研究方法:
　　 通過(guò)四步膠原酶灌注法與密度梯度離心技術(shù)相結(jié)合,分離正常成年大鼠肝祖細(xì)胞。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、RT-PCR和免疫細(xì)胞化學(xué)分析肝祖細(xì)胞

5、的形態(tài)、表型。
　　 研究結(jié)果:
　　 采用本課題組建立的四步膠原酶灌注法與密度梯度離心技術(shù)相結(jié)合,可從正常大鼠肝臟中分離出細(xì)胞數(shù)為2.5±0.5×104／100g的肝祖細(xì)胞,肝祖細(xì)胞的活率是95％／±2％。新鮮分離的大鼠肝祖胞用含10％胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液制成肝祖細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中體外培養(yǎng)。結(jié)果顯示體外培養(yǎng)的第3天,肝祖細(xì)胞可形成松散的克隆,細(xì)胞形態(tài)上為圓形或卵圓形。在體外30天的培養(yǎng)期間,這些細(xì)胞緩慢增殖

6、,并顯示出祖細(xì)胞的特性。RT-PCR結(jié)果顯示這群祖細(xì)胞不僅表達(dá)成熟肝細(xì)胞的表面標(biāo)志ALB、AFP、CK18、CK19、HNF-1a、HNF-4a的mRNA,還表達(dá)造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志Thy-1、CD45的mRNA。免疫細(xì)胞化學(xué)染色表明這群細(xì)胞表達(dá)ALB、AFP、CK18、CK19、Thy-1和OV-6。
　　 結(jié)論:
　　 通過(guò)簡(jiǎn)單有效的四步灌流法結(jié)合密度梯度離心法所獲得的肝祖細(xì)胞有良好的增殖能力,能表達(dá)干細(xì)胞和肝細(xì)胞的