松材線蟲PCR快速檢測方法的研究.pdf

1、松材線蟲病(pinewilt disease)是松屬的一種毀滅性病害，具有發(fā)病致死速度快、傳播蔓延迅速、防治難度大等特點，是嚴(yán)重威脅全世界林業(yè)生產(chǎn)的重大檢疫性病害之一。該病由松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)引起，目前國內(nèi)外尚無很好的根除方法，唯有通過設(shè)立和建設(shè)無病區(qū)、加強植物檢疫嚴(yán)防病害傳入。因此，加強病害的早期診斷和檢測技術(shù)的研究尤為重要。松材線蟲的傳統(tǒng)檢測技術(shù)(如形態(tài)鑒定、生理生化鑒定方法等)或多或少存

2、在一定的局限性，如特異性差、靈敏度低等，尤為關(guān)鍵的是不能對病害進行早期快速準(zhǔn)確檢測。而核酸水平的分子檢測技術(shù)，特別是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)作為檢測技術(shù)具有快速、特異、靈敏的特點，可以滿足國內(nèi)外現(xiàn)代植物檢疫的要求。 研究目的：本文對松材線蟲核酸分子檢測技術(shù)進行了系統(tǒng)的研究，旨在建立起快速準(zhǔn)確穩(wěn)定安全的松材線蟲分子檢測技術(shù)體系，實現(xiàn)松材線蟲樣品的快速檢驗，為松樹非疫區(qū)生產(chǎn)建設(shè)和病害預(yù)警監(jiān)測提供一種分子檢測技術(shù)和實用工具。

3、研究內(nèi)容和方法：比較改進CTAB法、試劑盒法和浸泡過濾法提取松材線蟲和擬松材線蟲(B．mucroratus)DNA的適用性；利用引物設(shè)計軟件Primer Premier5.0進行引物的設(shè)計；PCR同步擴增擬松材線蟲、小桿線蟲(Caenorhabd itis spp)、偽傘滑刃線蟲(B.fraudulentus)和其他腐生線蟲(saprophytic nematodes)等多種線蟲來驗證檢測的特異性；PCR擴增松材線蟲基因組DNA以測定檢

4、測的靈敏度；通過在不同DNA擴增儀和溫度控制方式下的擴增程序測定檢測的穩(wěn)定性；將DNA靶片段與克隆載體pMD-18T連接后，用CaCl<,2>法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichia．coli，JM109)，然后通過測序來驗證PCR擴增產(chǎn)物的準(zhǔn)確性；以重組質(zhì)粒和轉(zhuǎn)化的大腸桿菌構(gòu)建了無害化陽性參照體系；采用預(yù)混PCR反應(yīng)液中加入生物活性分子穩(wěn)定劑(MS)并冷凍干燥固相化處理的方法研制出能常溫貯存的方便有效的檢測試劑盒。利用優(yōu)化的分子檢測體系

5、對天津、廣西、湖南、重慶和四川等地采集的松木樣品進行了PCR實際檢測；利用BIO-RAD iCycler<'iQ>定量PCR儀對松材線蟲的定量檢測做了初步的研究。 研究結(jié)果： ①通過比較研究不同制樣方法對檢測效果的影響，確定浸泡過濾法能有效地排除植物色素、蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)對PCR反應(yīng)的干擾，可以從木屑中直接提取適合于PCR反應(yīng)的松材線蟲DNA模板，檢測限度到達(dá)了1條線蟲/1.5g木屑，建立了從木屑中快速提取線蟲DNA的

6、制樣方法。 ②根據(jù)松材線蟲特異的基因序列設(shè)計不同的引物對，通過比較篩選出特異性強、穩(wěn)定性好、靈敏度高(靈敏度達(dá)到200 pg/25μL)的引物對cqubs01/cquba01，并由此建立了準(zhǔn)確、快速、靈敏、穩(wěn)定、安全的松材線蟲PCR檢測體系。③根據(jù)擬松材線蟲特異的基因序列設(shè)計不同的引物對，通過比較篩選出特異性強穩(wěn)定性好靈敏度高的引物對cqubms01/cqubma01，并與松材線蟲引物cqubs01/cquba01組合，由此建立

7、了準(zhǔn)確、快速、靈敏、穩(wěn)定、安全的松材線蟲和擬松材線蟲雙重PCR檢測體系。 ④cqubs01/cquba01用于SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測，靈敏度達(dá)到100 fg/25μL，與常規(guī)PCR相比更靈敏、更簡便、更快速，且保持了較低的檢測成本。 ⑤利用浸泡過濾方法提取的線蟲總DNA由于含量不同而且保存期限短，不宜作為陽性對照。而以轉(zhuǎn)化的病菌靶序列重組質(zhì)粒DNA和重組子作為陽性對照，不僅檢測穩(wěn)定、效果理想，而且

8、安全可靠，可以用作定量檢測的標(biāo)準(zhǔn)樣品。 ⑥預(yù)混PCR反應(yīng)液中加入適量的生物活性分子穩(wěn)定劑，對DNA聚合酶，dNTPs等生物大分子具有良好的常溫穩(wěn)定作用，含有MS的預(yù)混PCR反應(yīng)試劑經(jīng)冷真空凍干燥處理后可以于常溫下保存至少半年以上。 結(jié)論：本研究利用改良的DNA提取方法及構(gòu)建的重組陽性對照，成功的建立了快速、穩(wěn)定、可靠的松材線蟲定性及定量分子檢測體系。從樣品的制備到獲得最終的檢測結(jié)果，該體系僅用時6h，符合實際檢測的要求。