松材線蟲實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)和腐爛莖線蟲種群分化的研究.pdf

1、1.松材線蟲real-time PCR檢測(cè)技術(shù)研究松材線蟲病(Pine Wood Nematode)是當(dāng)前嚴(yán)重危害我國和世界林業(yè)安全的森林毀滅性病害，其病原物松材線蟲[Bursaphelenchus xylophilus(Steiner & Buhrer)Nickle]是我國禁止進(jìn)境的檢疫性線蟲。不過，傘滑刃屬(Bursaphelenchus)線蟲中除松材線蟲外，其它線蟲并未引起明顯的植物病害。因此，建立一套快速、準(zhǔn)確的松材線蟲診斷方法

2、，對(duì)口岸檢疫和保護(hù)我國林業(yè)安全具有重要意義。實(shí)時(shí)熒光PCR是近年發(fā)展起來的新一代PCR技術(shù)，相比普通PCR方法，具有快速，環(huán)保，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。本研究設(shè)計(jì)合成了松材線蟲的TaqMan探針及其配套引物，并且在對(duì)7個(gè)松材線蟲種群，7個(gè)擬松材線蟲種群以及水對(duì)照進(jìn)行的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)中，快速準(zhǔn)確的將松材線蟲檢測(cè)出來。實(shí)時(shí)熒光PCR法的檢測(cè)靈敏度可達(dá)1/20條線蟲。 2.腐爛莖線蟲、鱗球莖莖線蟲和食菌莖線蟲的PCR-RFLP分析甘薯莖線蟲病

3、是農(nóng)業(yè)上重要病害，其病原腐爛莖線蟲(Ditylenchus destructor)為重要檢疫性線蟲。腐爛莖線蟲最初是在馬鈴薯上發(fā)現(xiàn)的，并導(dǎo)致馬鈴薯腐爛。但在我國主要危害甘薯的生產(chǎn)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)7個(gè)腐爛莖線蟲群體，2個(gè)鱗球莖莖線蟲群體以及1個(gè)食菌莖線蟲群體的ITS區(qū)進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和RFLP等分析，獲得了以上10個(gè)群體的RFLP圖譜，并通過網(wǎng)絡(luò)軟件Clustalwl.82對(duì)三種莖線蟲的核糖體：ITS區(qū)核酸序列進(jìn)行了比對(duì)。擴(kuò)增結(jié)果表明，腐爛莖線

4、蟲7個(gè)供試群體出現(xiàn)了兩種擴(kuò)增條帶，分別為790bp和970bp說明腐爛莖線蟲的不同群體間很可能出現(xiàn)了分化現(xiàn)象；2個(gè)鱗球莖莖線蟲群體DiIT和DiGR以及來自浙江溫州的1個(gè)食菌莖線蟲群體Dmzw的擴(kuò)增片段也在800 bp左右。酶切結(jié)果顯示：2個(gè)山東的腐爛莖線蟲群體與其他地區(qū)的5個(gè)腐爛莖線蟲群體在RsaⅠ、HaeⅢ、HinfⅠ、AluⅠ4個(gè)酶的酶切位點(diǎn)上存在明顯差異；雖然2個(gè)鱗球莖莖線蟲群體和1個(gè)食菌莖線蟲群體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物均為800 b