葛根提取物對神經根型頸椎病大鼠根性疼痛的作用及機制研究.pdf

1、一、目的與意義： 頸椎病又稱頸椎綜合癥，是頸部椎間盤、骨骼、軟骨、韌帶發(fā)生退行性變，繼發(fā)性刺激或壓迫周圍或臨近的脊髓、神經根、血管、軟組織、交感神經等組織結構，并由此而引起各種不適的一組癥候群。神經根型頸椎病是頸椎病中發(fā)病率最高的一種類型，約占其總發(fā)病率的60％～70％。神經根型頸椎病是神經根受各種因素侵襲損傷而導致其支配區(qū)域感覺、運動及反射障礙而引發(fā)的以疼痛為主要臨床表現的一種疾病。醫(yī)學界最早關于頸椎病的概念，大多源于神經根型

2、。神經根型頸椎病的主要癥狀為根性神經痛。目前對神經根型頸椎病根性痛的確切機制尚不完全清楚，但機械壓迫因素和生物化學因素在發(fā)病機制中的作用得到越來越多的認同。 為了研究葛根素治療神經根型頸椎病根性痛的可能機制，探討葛根素對受損的頸神經根的修復作用，本課題組從神經行為學、神經形態(tài)學和神經電生理學角度進行研究，既為了探討葛根對神經根型頸椎病根性痛及其受損神經根修復的作用，也為明確中藥復方“頸椎舒”的療效機制提供實驗依據。 二、

3、方法與內容： 1.葛根藥材的鑒定 薄層色譜鑒定照薄層色譜法(附錄VIB)試驗，吸取上述兩種溶液各10μl，分別點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H薄層板上，使成條狀，以三氯甲烷-甲醇-水(7:2.5:0.25)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜圖相應的位置上，顯示相同顏色的熒光斑點。 葛根中葛根素含量的測定根據2005版《中國藥典(一部)》中規(guī)定，按照高效

4、液相色譜法測定，葛根干燥品中葛根素含量不低于2.4％。 2.葛根素最佳提取工藝的確定及質量控制標準的建立 2.1最佳提取工藝的確定以葛根素為指標，以料液比(14:1、16:1、18:1)g、提取時間(1、1.5、2)h、提取次數(1、2、3)次為考察因素，按L9(34)正交表進行正交試驗，比較水提取法和乙醇提取法，確定葛根提取的最佳工藝及質量控制標準. 2.2質量控制標準的建立按照最佳提取工藝做三批驗證試驗求得R

5、SD值，計算平均濃度。 3.模型的建立及干預 所有大鼠在造模術前行左側SLSEP檢測，獲取參考值。仿照文獻[13]施行椎管插線造模手術，略作改進：以0.8cm長、直徑0.55mm尼龍漁線制備成插線，C7椎板開窗后，分別沿脊髓縱軸插入至C7-T1，及C5-C7神經根處，部分重疊，牢固嵌入骨性椎管內。術中及術后死亡7只。余53只大鼠在術后第5天接受評價，篩選符合以下條件：①造模前后術側E'-C6Lat的增長為0.2-0.4m

6、s；②步態(tài)評分為2-3分，無脊髓壓迫癥狀，共47只大鼠入組。隨機編號，使用excel均衡生成5個處理組，每組8只：生理鹽水組、葛根提取物低、中、高劑量組、頸復康組。頸復康組用頸復康顆粒配制成密度為1:1溶液，所有處理組給藥均定容到3ml灌胃。治療期間對大鼠進行行為學觀察記錄自發(fā)疼痛行為和步態(tài)異常評分，治療10天后行正中神經短潛伏期體感誘發(fā)電位(SLSEP)測定和壓線段脊髓及神經根病理切片的制作與觀察。 4.葛根提取物對受損神經根

7、修復作用的評價 行為學觀察實驗開始及結束時分別測量大鼠體重；每日在9:00-10:30間將大鼠放置在觀察箱中30min后觀察：有無自噬、舔咬、嘶叫等；記錄5min(300s)內患肢離地的累積時間，取三次的平均值；結合Kawakami與Dubuisson法對其由疼痛攣縮造成的步態(tài)障礙進行評估：1分=正常步態(tài)、足無畸形；2分=受損傷足輕觸玻璃臺面，不持重或輕微持重，走時跛行；足內收蜷縮畸形；3分=受損足抬起，走動時不著臺面；伴明顯足

8、內收蜷縮畸形。 正中神經短潛伏期體感誘發(fā)電位(SLSEP)測定方法如文獻[13]，刺激和記錄均使用2402號針灸針，參考電極置于附近1cm處皮下，刺激正中神經。記錄并計算術側Erb's點與C6椎板上點潛伏期的差值(E'-C6Lat)、C6椎板上點波幅(C6Amp)，Erb's點與C6椎板測量點距離，計算體感誘發(fā)電位傳導速度(MCV)。 病理切片的制作與觀察大鼠各項指標檢測完成后，大劑量麻醉致死，迅速取出壓線段脊髓及神經根

9、，固定、石蠟包埋，進行HE染色，光鏡下觀察軸索、髓鞘和神經元的形態(tài)及神經內膜及間質內血管的變化、是否有異常物質的沉積和炎癥細胞的浸潤等來明確病變性質；分別統(tǒng)計各組：神經細胞空泡樣變、壞死灶、軸突扭曲髓鞘脫失呈魚骨狀等陽性病變的病例數。 5.數據處理 提取工藝的優(yōu)化使用正交設計(Orthogonaldesign)；使用SPSS11.5行單因素重復測量數據的方差分析(RepeatedMeasures)，Mauchly球形檢驗

10、結果，若P>0.05，滿足球形假設，無需校正；若P≤0.05，則不滿足球形假設，用ε校正系數為Greenhouse-Geisser校正的結果。計量數據用均數士標準差(x±s)描述，治療前后用配對t檢驗，各組間比較用單向方差分析(One-WayANOVA)。 三、結果： 實驗大鼠均無明顯的體重減輕，傷口愈合良好，無自噬及舔咬，無膿性分泌物。 1.葛根提取物對大鼠頸神經根性疼痛行為的影響 在術后5天時，分別評

11、價各組自發(fā)疼痛行為和步態(tài)異常評分差異無顯著性意義(P>0.05)。實驗結束時，生理鹽水組的大鼠上肢仍彎曲緊貼胸口，其前肢避免觸地，觸地部位為肘部，其5分鐘內前肢離地時間值無明顯變化，步態(tài)蹣跚，軀體傾斜；EP高、中、低劑量治療組的大鼠疼痛相關行為明顯減輕，四肢趨向于平等支持體重，腕部或爪背部觸地，呈稍不平衡步態(tài)。 2.葛根提取物對大鼠受損神經根修復的影響 生理鹽水組大鼠的組織病理切片形態(tài)學觀察見神經元壞死，假單極神經細胞結

12、構消失，形成衛(wèi)星細胞環(huán)繞的空洞；后根神經軸突及膜細胞結構不清，雪旺細胞核堆積，軸突有斷裂，周圍銹鞘消失，形成空洞；脊髓白質的后索、外側索呈空泡樣變性，脊髓灰質、白質處均有膠質細胞增生。葛根提取物高、中、低劑量組和頸復康組神經損傷程度較輕，出現節(jié)細胞空泡變性，壞死及髓鞘魚骨變的例數較少，提示葛根提取物對大鼠受損神經有修復和保護作用。 3.葛根提取物對大鼠受損神經根電生理的影響 3.1對C6椎板上點波幅(C6Amp)的影響不

13、同組之間評分結果無顯著性差異(F=6.878，P<0.001)，治療前后評分結果有顯著差異(F=1394.719，P<0.001)；在不同分組之間，除生理鹽水組(t=0.890，P=0.403)無顯著性差異，其余各組經配對t檢驗，結果均有顯著差異，t值分別為28.714、17.540、12.529和21.616，均為P<0.001。從不同組來看，治療前差異沒有統(tǒng)計學意義(F=0.822，P=0.520)，治療后評分結果差異有顯著差異(F

14、=14.432，P<0.001)，其中以頸復康組療效最顯著。各組與治療前后之間存在交互效應(F=93.059，P<0.001)，由表可知，治療后波幅的最大值在頸復康組，最小值在治療后生理鹽水組； 3.2對潛伏期的差值(E'-C6Lat)的影響不同組之間評分結果無顯著性差異(F=20.025，P<0.001)，治療前后評分結果有顯著差異(F=384.062，P<0.001)；在不同分組之間，除生理鹽水組(t=0.314，P=0.7

15、63)無顯著性差異，其余各組經配對t檢驗，結果均有顯著差異，t值分別為11.081、9.178、16.024和10.299，均為P<0.001。從不同組來看，治療前差異沒有統(tǒng)計學意義(F=0.368，P=0.830)，治療后評分結果差異有顯著差異(F=39.430，P<0.001)，其中以頸復康組療效最顯著。各組與治療前后之間存在交互效應(F=27.133，P<0.001)，由表可知，治療后潛伏期差值的最大值在生理鹽水組，最小值在治療后

16、頸復康組； 3.3對體感誘發(fā)電位傳導速度(MCV)的影響不同組之間評分結果有顯著性差異(F=3.183，P=0.025)，治療前后評分結果有顯著差異(F=187.437，P<0.001)；在不同分組之間，生理鹽水組(t=0.708，P=0.502)無顯著性差異，高劑量組(t=9.642，P<0.001)、中劑量組(t=5.170，P=0.001)和低劑量組(t=14.803，P<0.001)結果均有顯著性差異。從不同組來看，治療

17、前差異沒有統(tǒng)計學意義(F=0.394，P=0.812)，治療后評分結果差異有顯著差異(F=9.327，P<0.001)，其中以高劑量組療效最顯著。各組與治療前后之間存在交互效應(F=16.372，P<0.001)，由表可知，治療后傳導速度最大值在頸復康組，最小值在治療后生理鹽水組； 四、結論： 1.葛根提取物對神經根型頸椎病神經根性疼痛大鼠有較好的止痛作用，當葛根提取物中含葛根素劑量為266.1、133.0、66.5mg