川芎提取物對神經(jīng)根型頸椎病根性疼痛治療作用及機制研究.pdf

1、一、目的與意義： 神經(jīng)根型頸椎病(cervicalspondyloticradiculopathy，CSR)臨床常見高發(fā)，人群總患病率達11.59-24.18％。CSR是指由于頸椎退變、神經(jīng)根受壓迫等因素導(dǎo)致其支配區(qū)域出現(xiàn)一定程度的疼痛、麻木、感覺缺失和運動功能改變，其主要癥狀為根性神經(jīng)痛(radicularncuralgia)。臨床許多CSR患者通過中醫(yī)藥治療可以獲得滿意的效果。中藥川芎具有行氣開郁、祛風燥濕、活血止痛的功效，

2、是臨床治療神經(jīng)根型頸椎病的主要藥物，研究川芎具有重要的科學(xué)價值和社會經(jīng)濟效益。 川芎內(nèi)多種活性成分如揮發(fā)油類(如藁本內(nèi)酯)、酚酸類(如阿魏酸)、生物堿類(如川芎嗪)等，分別通過改善微循環(huán)、穩(wěn)定細胞膜、抗自由基等多個環(huán)節(jié)起到神經(jīng)保護作用。而某些針對川芎嗪的提取法會造成其它有效成分的損失，并且川芎中川芎嗪含量非常低，大約占川芎中的千萬分之幾，所以提取方法應(yīng)兼顧所有傳統(tǒng)應(yīng)用川芎治療疾病的主要活性成分。故我們在本藥理實驗中根據(jù)治療目的選

3、擇了合適的提取方法。同時對藥理學(xué)實驗的提取物進行質(zhì)量控制，選擇含量較高、HPLC檢測靈敏度高、其藥理作用與實驗?zāi)康闹苯酉嚓P(guān)的阿魏酸作為定量指標，采用質(zhì)量標準控制藥理學(xué)實驗劑量的有效物質(zhì)濃度，對川芎治療作用的量效關(guān)系進行更精確的衡量。 觀察川芎對神經(jīng)根型頸椎病大鼠受損神經(jīng)根是否具有形態(tài)保護作用，以及相關(guān)的促進神經(jīng)電生理恢復(fù)、進而治療減輕疼痛的作用，以這種量化研究為臨床用藥提供劑量參考。 二、供試藥液的制備及質(zhì)量控制：

4、 1.供試品溶液的制備方法 川芎飲片加入8倍量水，不泡，冷凝回流水提4小時，收集揮發(fā)油備用過濾，減壓濃縮加入揮發(fā)油混勻。 2.質(zhì)量控制 精密量取稀釋定容于10ml容量瓶中，搖勻，取適量用微孔濾膜(0.45μm)濾過，取續(xù)濾液即得。依據(jù)05藥典對川芎提取液進行化學(xué)成分薄層色譜法(TLC)定性分析(附錄appendixVIB)；高效液相色譜儀(HPLC)測定阿魏酸(FA)含量作為定量指標。 三、模型的建立及

5、干預(yù)： 1.模型的建立及干預(yù) 所有大鼠在造模術(shù)前行左側(cè)誘發(fā)電位檢測，獲取正常值。仿照文獻[5]施椎管插線造模手術(shù)，略作改進：以0.8cm長直徑0.55mm尼龍漁線制備插線，C7椎板開窗后，分別沿脊髓縱軸插入至C4-C7、C6-T1頸脊神經(jīng)肩上，部分重疊。 入組標準術(shù)中及術(shù)后死亡4只。余50只大鼠在術(shù)后第5天接受評價篩選符合條件：①造模前后術(shù)側(cè)E'-C6Lat的增長為0.2-0.4ms；②步態(tài)評分為2-3分，無脊髓

6、壓迫癥狀。頸復(fù)康及模型組分別給1:1顆粒溶液1ml·kg-1·d-1及生理鹽水，所有處理組給藥均定容到3ml灌胃，給藥時間為10天。 共42只大鼠符合要求。隨機抽取40只大鼠進入實驗，隨機分為5個處理組：川芎藥液高、中、低劑量組、模型組、頸復(fù)康組。藥理實驗高、中、低劑量組川芎提取物每日劑量中FA含量分別控制為：252.2、126.1、63.05mg·kg-1·d-1。 2.模型評價方法 行為學(xué)觀察實驗開始及結(jié)束時

7、分別測量大鼠體重；每日在9:00-10:30間將大鼠放置在觀察箱中30min后觀察：有無自噬、舔咬、嘶叫等；接觸記錄5min內(nèi)患肢離地的累積時間，取三次的平均值；結(jié)合Kawakami與Dubuisson法對其由疼痛攣縮造成的步態(tài)障礙進行評估：1分=正常步態(tài)、足無畸形；2分=受損傷足輕觸玻璃臺面，不持重或輕微持重，走時跛行；足內(nèi)收蜷縮畸形；3分=受損足抬起，走動時不著臺面；伴顯著足內(nèi)收蜷縮畸形。 神經(jīng)電生理測量方法如文獻，刺激和記

8、錄均使用2402號針灸針，參考電極置于附近1cm處皮下，余同文獻。記錄并計算術(shù)側(cè)鎖骨上窩(Erb's)點與C6椎板上點潛伏期的差值(Lat)、C6椎板上點波幅(Amp)，計算感覺電位傳導(dǎo)速度(MCV)，每次測量重復(fù)兩次取均值。 病理切片的制作與觀察方法如文獻，HE染色，光鏡觀察有無神經(jīng)水腫及炎癥細胞浸潤等。在光鏡下放大10×20倍觀察，每一病例隨機取3張切片，每張切片隨機取5個視野，分別統(tǒng)計各組出現(xiàn)：神經(jīng)細胞空泡樣變、壞死灶、軸

9、突扭曲髓鞘脫失呈魚骨狀等陽性病變的病例數(shù)。 統(tǒng)計處理計量資料以均數(shù)±標準差(x±s)表示，使用SPSS11.5行單因素方差分析，神經(jīng)電生理與行為學(xué)測量數(shù)據(jù)的組間差異均使用LSD-t檢驗。 3.結(jié)果： 3.1TLC鑒定結(jié)果 川芎內(nèi)化學(xué)成分符合要求，HPLC檢測求得提取物濃度為46.4939mg·ml-1；三批驗證試驗RSD=1.88，故藥液(1:1)中FA的平均濃度45.0365mg·ml-1。 3

10、.2川芎提取物對神經(jīng)根型頸椎病大鼠根性疼痛行為的影響 所有大鼠無一脫失，均進入實驗結(jié)果分析，無顯著的體重減輕。傷口愈合良好，無膿性分泌物，無自噬及舔咬。實驗結(jié)束時，模型組大鼠疼痛行為無顯著改善，川芎提取物高、中、低劑量組治療后自發(fā)痛分值顯著降低(ANOVA，P=0.005)，治療前后測量的自發(fā)痛差值與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義降低(ANOVA，P<0.000)；步態(tài)障礙分值顯著降低降低(ANOVA，P=0.001)：治療前后測量

11、的步態(tài)障礙差值與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義降低(ANOVA，P=0.015)。 3.3川芎提取物對神經(jīng)根型頸椎病根性疼痛大鼠神經(jīng)電生理的影響 模型組實驗結(jié)束誘發(fā)電位潛伏期、波幅、傳導(dǎo)速度無顯著恢復(fù)或未恢復(fù)到正常水平.川芎提取物高、中、低劑量組治療后因造模增長的潛伏期顯著減短，與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(ANOVA，P<0.000)，治療前及治療后兩次所測潛伏期的差值與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(ANOVA，P<0.00

12、0)；治療后感覺電位傳導(dǎo)速度顯著恢復(fù)，與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(ANOVA，P<0.000)，治療前及治療后兩次所測感覺電位傳導(dǎo)速度的差值與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(ANOVA，P<0.0001；治療后測量的波幅差值與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(ANOVA，P=0.002)，治療前及治療后兩次所測波幅的差值與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義降低(ANOVA，P<0.000)。 3.4川芎提取物對神經(jīng)根型頸椎病根性疼痛大鼠神經(jīng)根病

13、理形態(tài)的影響 模型組大鼠頸神經(jīng)根組織病理切片形態(tài)學(xué)觀察神經(jīng)變性較嚴重，顯著地水腫變性空泡變的例數(shù)為5，神經(jīng)節(jié)細胞壞死灶的例數(shù)為4，軸突髓鞘脫失、扭曲呈魚骨狀變性的例數(shù)為4。川芎提取物治療組神經(jīng)損傷程度較輕，高劑量組出現(xiàn)上述嚴重變性的例數(shù)分別2、1、2；中劑量組出現(xiàn)上述嚴重變性的例數(shù)分別為3、2、3；低劑量組出現(xiàn)上述嚴重變性的例數(shù)分別3、3、3。 四、結(jié)論： 1.對于采用傳統(tǒng)水提合并揮發(fā)油采集法提供的川芎內(nèi)有效物質(zhì)

14、，高效液相色譜儀測定阿魏酸含量是穩(wěn)定靈敏的質(zhì)量控制手段，不僅可以反映提取物中有效物質(zhì)的含量，同時也和藥物的療效成正比，是合適的藥理實驗指標。 2.采用尼龍漁線對頸神經(jīng)根及背根節(jié)的卡壓法可以建立穩(wěn)定的神經(jīng)根型頸椎病根性痛的動物模型，正中神經(jīng)短潛伏期誘發(fā)電位是神經(jīng)根損傷及好轉(zhuǎn)的情況的可靠檢測手段。 3.川芎提取物在FA劑量為252.2、126.1、63.05mg·kg-1·d-1時對椎管插線法建立的神經(jīng)根型頸椎病根性痛大鼠具