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1、一、目的與意義: 神經(jīng)根型頸椎病(cervicalspondyloticradiculopathy,CSR)臨床常見(jiàn)高發(fā),人群總患病率達(dá)11.59-24.18%。CSR是指由于頸椎退變、神經(jīng)根受壓迫等因素導(dǎo)致其支配區(qū)域出現(xiàn)一定程度的疼痛、麻木、感覺(jué)缺失和運(yùn)動(dòng)功能改變,其主要癥狀為根性神經(jīng)痛(radicularncuralgia)。臨床許多CSR患者通過(guò)中醫(yī)藥治療可以獲得滿意的效果。中藥川芎具有行氣開郁、祛風(fēng)燥濕、活血止痛的功效,
2、是臨床治療神經(jīng)根型頸椎病的主要藥物,研究川芎具有重要的科學(xué)價(jià)值和社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。 川芎內(nèi)多種活性成分如揮發(fā)油類(如藁本內(nèi)酯)、酚酸類(如阿魏酸)、生物堿類(如川芎嗪)等,分別通過(guò)改善微循環(huán)、穩(wěn)定細(xì)胞膜、抗自由基等多個(gè)環(huán)節(jié)起到神經(jīng)保護(hù)作用。而某些針對(duì)川芎嗪的提取法會(huì)造成其它有效成分的損失,并且川芎中川芎嗪含量非常低,大約占川芎中的千萬(wàn)分之幾,所以提取方法應(yīng)兼顧所有傳統(tǒng)應(yīng)用川芎治療疾病的主要活性成分。故我們?cè)诒舅幚韺?shí)驗(yàn)中根據(jù)治療目的選
3、擇了合適的提取方法。同時(shí)對(duì)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)的提取物進(jìn)行質(zhì)量控制,選擇含量較高、HPLC檢測(cè)靈敏度高、其藥理作用與實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹苯酉嚓P(guān)的阿魏酸作為定量指標(biāo),采用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)劑量的有效物質(zhì)濃度,對(duì)川芎治療作用的量效關(guān)系進(jìn)行更精確的衡量。 觀察川芎對(duì)神經(jīng)根型頸椎病大鼠受損神經(jīng)根是否具有形態(tài)保護(hù)作用,以及相關(guān)的促進(jìn)神經(jīng)電生理恢復(fù)、進(jìn)而治療減輕疼痛的作用,以這種量化研究為臨床用藥提供劑量參考。 二、供試藥液的制備及質(zhì)量控制:
4、 1.供試品溶液的制備方法 川芎飲片加入8倍量水,不泡,冷凝回流水提4小時(shí),收集揮發(fā)油備用過(guò)濾,減壓濃縮加入揮發(fā)油混勻。 2.質(zhì)量控制 精密量取稀釋定容于10ml容量瓶中,搖勻,取適量用微孔濾膜(0.45μm)濾過(guò),取續(xù)濾液即得。依據(jù)05藥典對(duì)川芎提取液進(jìn)行化學(xué)成分薄層色譜法(TLC)定性分析(附錄appendixVIB);高效液相色譜儀(HPLC)測(cè)定阿魏酸(FA)含量作為定量指標(biāo)。 三、模型的建立及
5、干預(yù): 1.模型的建立及干預(yù) 所有大鼠在造模術(shù)前行左側(cè)誘發(fā)電位檢測(cè),獲取正常值。仿照文獻(xiàn)[5]施椎管插線造模手術(shù),略作改進(jìn):以0.8cm長(zhǎng)直徑0.55mm尼龍漁線制備插線,C7椎板開窗后,分別沿脊髓縱軸插入至C4-C7、C6-T1頸脊神經(jīng)肩上,部分重疊。 入組標(biāo)準(zhǔn)術(shù)中及術(shù)后死亡4只。余50只大鼠在術(shù)后第5天接受評(píng)價(jià)篩選符合條件:①造模前后術(shù)側(cè)E'-C6Lat的增長(zhǎng)為0.2-0.4ms;②步態(tài)評(píng)分為2-3分,無(wú)脊髓
6、壓迫癥狀。頸復(fù)康及模型組分別給1:1顆粒溶液1ml·kg-1·d-1及生理鹽水,所有處理組給藥均定容到3ml灌胃,給藥時(shí)間為10天。 共42只大鼠符合要求。隨機(jī)抽取40只大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn),隨機(jī)分為5個(gè)處理組:川芎藥液高、中、低劑量組、模型組、頸復(fù)康組。藥理實(shí)驗(yàn)高、中、低劑量組川芎提取物每日劑量中FA含量分別控制為:252.2、126.1、63.05mg·kg-1·d-1。 2.模型評(píng)價(jià)方法 行為學(xué)觀察實(shí)驗(yàn)開始及結(jié)束時(shí)
7、分別測(cè)量大鼠體重;每日在9:00-10:30間將大鼠放置在觀察箱中30min后觀察:有無(wú)自噬、舔咬、嘶叫等;接觸記錄5min內(nèi)患肢離地的累積時(shí)間,取三次的平均值;結(jié)合Kawakami與Dubuisson法對(duì)其由疼痛攣縮造成的步態(tài)障礙進(jìn)行評(píng)估:1分=正常步態(tài)、足無(wú)畸形;2分=受損傷足輕觸玻璃臺(tái)面,不持重或輕微持重,走時(shí)跛行;足內(nèi)收蜷縮畸形;3分=受損足抬起,走動(dòng)時(shí)不著臺(tái)面;伴顯著足內(nèi)收蜷縮畸形。 神經(jīng)電生理測(cè)量方法如文獻(xiàn),刺激和記
8、錄均使用2402號(hào)針灸針,參考電極置于附近1cm處皮下,余同文獻(xiàn)。記錄并計(jì)算術(shù)側(cè)鎖骨上窩(Erb's)點(diǎn)與C6椎板上點(diǎn)潛伏期的差值(Lat)、C6椎板上點(diǎn)波幅(Amp),計(jì)算感覺(jué)電位傳導(dǎo)速度(MCV),每次測(cè)量重復(fù)兩次取均值。 病理切片的制作與觀察方法如文獻(xiàn),HE染色,光鏡觀察有無(wú)神經(jīng)水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等。在光鏡下放大10×20倍觀察,每一病例隨機(jī)取3張切片,每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野,分別統(tǒng)計(jì)各組出現(xiàn):神經(jīng)細(xì)胞空泡樣變、壞死灶、軸
9、突扭曲髓鞘脫失呈魚骨狀等陽(yáng)性病變的病例數(shù)。 統(tǒng)計(jì)處理計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,使用SPSS11.5行單因素方差分析,神經(jīng)電生理與行為學(xué)測(cè)量數(shù)據(jù)的組間差異均使用LSD-t檢驗(yàn)。 3.結(jié)果: 3.1TLC鑒定結(jié)果 川芎內(nèi)化學(xué)成分符合要求,HPLC檢測(cè)求得提取物濃度為46.4939mg·ml-1;三批驗(yàn)證試驗(yàn)RSD=1.88,故藥液(1:1)中FA的平均濃度45.0365mg·ml-1。 3
10、.2川芎提取物對(duì)神經(jīng)根型頸椎病大鼠根性疼痛行為的影響 所有大鼠無(wú)一脫失,均進(jìn)入實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析,無(wú)顯著的體重減輕。傷口愈合良好,無(wú)膿性分泌物,無(wú)自噬及舔咬。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),模型組大鼠疼痛行為無(wú)顯著改善,川芎提取物高、中、低劑量組治療后自發(fā)痛分值顯著降低(ANOVA,P=0.005),治療前后測(cè)量的自發(fā)痛差值與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義降低(ANOVA,P<0.000);步態(tài)障礙分值顯著降低降低(ANOVA,P=0.001):治療前后測(cè)量
11、的步態(tài)障礙差值與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義降低(ANOVA,P=0.015)。 3.3川芎提取物對(duì)神經(jīng)根型頸椎病根性疼痛大鼠神經(jīng)電生理的影響 模型組實(shí)驗(yàn)結(jié)束誘發(fā)電位潛伏期、波幅、傳導(dǎo)速度無(wú)顯著恢復(fù)或未恢復(fù)到正常水平.川芎提取物高、中、低劑量組治療后因造模增長(zhǎng)的潛伏期顯著減短,與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ANOVA,P<0.000),治療前及治療后兩次所測(cè)潛伏期的差值與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ANOVA,P<0.00
12、0);治療后感覺(jué)電位傳導(dǎo)速度顯著恢復(fù),與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ANOVA,P<0.000),治療前及治療后兩次所測(cè)感覺(jué)電位傳導(dǎo)速度的差值與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ANOVA,P<0.0001;治療后測(cè)量的波幅差值與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ANOVA,P=0.002),治療前及治療后兩次所測(cè)波幅的差值與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義降低(ANOVA,P<0.000)。 3.4川芎提取物對(duì)神經(jīng)根型頸椎病根性疼痛大鼠神經(jīng)根病
13、理形態(tài)的影響 模型組大鼠頸神經(jīng)根組織病理切片形態(tài)學(xué)觀察神經(jīng)變性較嚴(yán)重,顯著地水腫變性空泡變的例數(shù)為5,神經(jīng)節(jié)細(xì)胞壞死灶的例數(shù)為4,軸突髓鞘脫失、扭曲呈魚骨狀變性的例數(shù)為4。川芎提取物治療組神經(jīng)損傷程度較輕,高劑量組出現(xiàn)上述嚴(yán)重變性的例數(shù)分別2、1、2;中劑量組出現(xiàn)上述嚴(yán)重變性的例數(shù)分別為3、2、3;低劑量組出現(xiàn)上述嚴(yán)重變性的例數(shù)分別3、3、3。 四、結(jié)論: 1.對(duì)于采用傳統(tǒng)水提合并揮發(fā)油采集法提供的川芎內(nèi)有效物質(zhì)
14、,高效液相色譜儀測(cè)定阿魏酸含量是穩(wěn)定靈敏的質(zhì)量控制手段,不僅可以反映提取物中有效物質(zhì)的含量,同時(shí)也和藥物的療效成正比,是合適的藥理實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。 2.采用尼龍漁線對(duì)頸神經(jīng)根及背根節(jié)的卡壓法可以建立穩(wěn)定的神經(jīng)根型頸椎病根性痛的動(dòng)物模型,正中神經(jīng)短潛伏期誘發(fā)電位是神經(jīng)根損傷及好轉(zhuǎn)的情況的可靠檢測(cè)手段。 3.川芎提取物在FA劑量為252.2、126.1、63.05mg·kg-1·d-1時(shí)對(duì)椎管插線法建立的神經(jīng)根型頸椎病根性痛大鼠具
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