華蟾素抗肝癌有效成分的篩選、鑒定及作用機(jī)制研究.pdf

1、華蟾素是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材中華大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans Cantor)陰干皮經(jīng)提取加工制成的滅菌水溶液，在我國(guó)廣泛應(yīng)用于肝癌等多種惡性腫瘤的治療。原發(fā)性肝癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率逐年呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著人類的健康。尋找高效、低毒副作用的藥物用于原發(fā)性肝癌的防治有著重大的臨床意義。臨床研究表明，華蟾素對(duì)預(yù)防和治療原發(fā)性肝癌具有較好的療效，在預(yù)防乙型肝炎向原發(fā)性肝癌轉(zhuǎn)變、穩(wěn)定或部分縮小肝癌病

2、灶、減輕不良反應(yīng)和提高患者生活質(zhì)量等方面發(fā)揮著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，其抗腫瘤作用主要與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。然而，華蟾素的化學(xué)成分相對(duì)復(fù)雜，抗腫瘤機(jī)制亦不明確。因此，進(jìn)一步分離、純化其有效活性成分，并闡明其作用機(jī)制，對(duì)于提高華蟾素臨床用藥的準(zhǔn)確性，以及開發(fā)新型抗腫瘤藥物均具有重大的意義。
　　 鑒于此，本研究在前期華蟾素抗腫瘤研究的基礎(chǔ)上，采用活性追蹤分離的方法，從華蟾素中篩選鑒定出兩種具有抗肝癌活性的蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類化合物，華蟾蜍精(cin

3、obufagin)和脂蟾蜍配基(resibufogenin)，通過體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)對(duì)活性相對(duì)較好的華蟾蜍精的抗腫瘤活性及作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究，并且測(cè)定了華蟾素中這兩種蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類化合物的含量；另外，對(duì)蟾皮超臨界CO2萃取物體外抗肝癌的活性及作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。本研究旨在為華蟾素進(jìn)一步的臨床應(yīng)用及相關(guān)抗肝癌藥物的開發(fā)及臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 1華蟾素抗肝癌有效成分的篩選和鑒定目的：篩選和鑒定華蟾素中抗肝癌的有效成分。方

4、法：采用活性追蹤分離的方法對(duì)華蟾素中抗肝癌的有效成分進(jìn)行篩選。采用MTT法對(duì)不同組分抑制HepG2細(xì)胞增殖的活性進(jìn)行測(cè)定?；钚越M分用部位分離、硅膠柱層析、制備型TLC以及HPLC進(jìn)行提取分離。采用NMR和EI-MS技術(shù)鑒定活性化合物的結(jié)構(gòu)。結(jié)果：通過一系列的活性追蹤分離實(shí)驗(yàn)，從華蟾素中分離獲得兩個(gè)具有抗腫瘤活性的有效組分，經(jīng)TLC和HPLC檢測(cè)證實(shí)其為兩個(gè)純度較高的化合物。通過將。1HNMR、13C NMR、DEPT及EI-MS的結(jié)果與

5、現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫及已發(fā)表文獻(xiàn)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，最終將兩個(gè)化合物分別鑒定為華蟾蜍精和脂蟾毒配基。結(jié)論：采用活性追蹤分離等方法，從華蟾素中篩選鑒定出兩個(gè)具有抗HepG2細(xì)胞增殖作用的活性化合物，華蟾蜍精和脂蟾毒配基。
　　 2華蟾蜍精體外抗肝癌活性及作用機(jī)制研究目的：對(duì)華蟾蜍精抑制HepG2細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行研究。方法：采用MTT法對(duì)華蟾蜍精和脂蟾毒配基抑制HepG2細(xì)胞增殖的作用進(jìn)行測(cè)定。采用Hoechst33258染色和

6、PI染色的方法對(duì)華蟾蜍精誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的作用進(jìn)行研究。采用Western blotting的方法對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3及Caspase-9的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：在0.0001 mg/mL-100 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，華蟾蜍精和脂蟾毒配基均有抑制HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，且呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間和劑量依賴性。作用24 h、48 h、72 h，華蟾蜍精對(duì)HepG2細(xì)胞的IC50分別為0.56μg/mL、2

7、.29×10-3μg/mL和1.02×10-3μg/mL；而脂蟾毒配基對(duì)HepG2細(xì)胞的IC50分別為6.95μg/mL、3.59μg/mL和3.15μg/mL。Hoechst33258染色及PI染色的結(jié)果表明，華蟾蜍精在體外具有明顯的誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的作用，表現(xiàn)為染色質(zhì)固縮、細(xì)胞核出現(xiàn)致密濃染或碎塊狀致密濃染等，0.04μg/mL的華蟾蜍精作用HepG2細(xì)胞24 h后，其凋亡率為22.24％。Western blotting的結(jié)

8、果顯示，蟾蜍精體可以使細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bcl-2的蛋白表達(dá)下調(diào)，而Bax、Caspase-3和Caspase-9的蛋白表達(dá)上調(diào)。結(jié)論：華蟾蜍精具有明顯的體外抑制HepG2細(xì)胞增殖的作用，作用機(jī)制與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)，受凋亡相關(guān)因子Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9調(diào)控。
　　 3華蟾蜍精對(duì)裸鼠人肝癌移植模型抗腫瘤作用的研究目的：通過建立裸鼠人肝癌(HepG2)移植模型，探討華蟾蜍精體內(nèi)抗腫瘤的活性及誘導(dǎo)細(xì)胞

9、凋亡的機(jī)制。方法：采用肝癌細(xì)胞(HepG2)皮下注射法，建立裸鼠人肝癌移植模型。待腫瘤長(zhǎng)至約100 mm3時(shí)，將40只模型裸鼠隨機(jī)分為大、中、小劑量組(華蟾蜍精給藥組)、陽性對(duì)照組(ADM組)和陰性對(duì)照組(NS組)，每組8只。通過觀察荷瘤裸鼠食欲、精神狀況及體重變化情況，對(duì)藥物的毒性進(jìn)行評(píng)價(jià)。通過測(cè)定給藥期間裸鼠腫瘤體積變化，對(duì)藥物抗腫瘤的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。采用HE染色法，觀察裸鼠人肝癌移植模型治療后腫瘤的壞死程度。采用TUNEL染色法觀察

10、檢測(cè)了裸鼠人肝癌移植模型治療后細(xì)胞凋亡的情況。采用Western blotting的方法檢測(cè)腫瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3及Caspase-9的表達(dá)情況。結(jié)果：通過將人肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞接種于裸鼠腋窩皮下，成功建立了裸鼠人肝癌(HepG2)移植模型，造模成功率>95％，然后分組給予不同的藥物處理。ADM組對(duì)人肝癌移植模型裸鼠具有一定的毒副作用，而華蟾蜍精0.5mg/kg、1 mg/kg及1.5 mg/k

11、g組均無明顯毒副作用。華蟾蜍精在毒性較小的情況下，對(duì)裸鼠人肝癌移植模型的腫瘤生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，且呈劑量依賴性。華蟾蜍精能明顯的誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，TUNEL染色法結(jié)果顯示華蟾蜍精0.5 mg/kg、1.0 mg/kg和1.5 mg/kg組的凋亡指數(shù)分別為：6.2±1.04、8.8±1.04、13.4±1.68，且呈劑量依賴性。Western blotting結(jié)果顯示蟾蜍精體可以使細(xì)胞凋亡相關(guān)因子Bcl-2的蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax

12、，Caspase-3和Caspase-9的蛋白表達(dá)上調(diào)。結(jié)論：華蟾蜍精對(duì)裸鼠人肝癌移植模型具有明顯的抗腫瘤作用，作用機(jī)制與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)，受凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9調(diào)控。
　　 5華蟾素抗腫瘤有效成分的含量測(cè)定目的：測(cè)定華蟾素中華蟾蜍精和脂蟾毒配基的含量。方法和結(jié)果：建立了HPLC測(cè)定華蟾素中華蟾蜍精和脂蟾毒配基的方法，色譜條件為C-18色譜柱(Waters，COSMOSIL Ch

13、olester，4.6 mm×150 mm，5μm)，流動(dòng)相為乙腈/水(45:55)，檢測(cè)波長(zhǎng)296mm，流速1 mL/min，柱箱溫度40℃，上樣量10μL，在此條件下，兩峰的分離度>1.5。對(duì)上述測(cè)定方法的線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性和加樣回收率進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明華蟾蜍精、脂蟾毒配基在相關(guān)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，濃度測(cè)定值的RSD分別為1.22％和0.73％，供試品溶液在常溫條件下24 h內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定，平均加樣回收率分別為98.2％(R

14、SD=1.76％)和100.8％(RSD=2.61％)，均符合檢測(cè)要求。采用上述色譜條件分別對(duì)3個(gè)不同批次的華蟾素濃縮液進(jìn)行了檢測(cè)，以外標(biāo)法計(jì)算3批樣品中華蟾蜍精和脂蟾毒配基的含量，結(jié)果顯示3批華蟾素中華蟾蜍精和脂蟾蜍配基的含量存在較大的差異，推測(cè)可能與華蟾素濃縮液儲(chǔ)存過程中的穩(wěn)定性或華蟾素濃縮液的質(zhì)量穩(wěn)定性有關(guān)。結(jié)論：建立了一種簡(jiǎn)便、精確、回收率較好的測(cè)定華蟾蜍精和脂蟾毒配基含量的方法。通過測(cè)定，不同批次華蟾素中有效成分的含量存在一定

15、的差異。
　　 6蟾皮超臨界CO2萃取物SCE-TS體外抗肝癌活性及作用機(jī)制研究目的：對(duì)SCE-TS抑制HepG2細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行研究。方法：采用高效液相色譜法測(cè)定了SCE-TS中華蟾蜍精和脂蟾蜍配基的含量，以外標(biāo)法對(duì)其中華蟾蜍精和脂蟾毒配基的含量進(jìn)行計(jì)算。采用MTT法對(duì)華蟾素和SCE-TS抑制HepG2細(xì)胞增殖的作用進(jìn)行測(cè)定。采用Hoechst33258染色和PI染色的方法對(duì)SCE-TS誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的

16、作用進(jìn)行研究。采用Western blotting的方法對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3及Caspase-9的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：SCE-TS中華蟾蜍精和脂蟾蜍配基的含量分別為334.3μg/mL和1211.7μg/mL，明顯高于華蟾素。華蟾素和SCE-TS均能顯著抑制Hq3C2細(xì)胞的增殖，且呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間和劑量依賴性。作用24 h、48 h、72 h，華蟾素對(duì)HepG2細(xì)胞的IC50以生藥蟾皮計(jì)分別為9.310

17、mg/mL、0.122 mg/mL和0.033 mg/mL；而SCE-TS對(duì)HepG2細(xì)胞的IC50以生藥蟾皮計(jì)分別為0.026 mg/mL、0.012 mg/mL和0.011 mg/mL，表明等量蟾皮提取獲得的SCE-TS中抑制HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)有效成分的含量明顯高于華蟾素。SCE-TS具有明顯的體外誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的作用，0.001 mg/mL、0.01 mg/mL SCE-TS作用48 h后，HepG2細(xì)胞的凋亡率分別為18