紅毛五加抗炎有效成分的篩選及其抗炎機(jī)制的初步研究.pdf

1、紅毛五加(AcanthopanaxgiraldiiHarms)是五加科植物，主要分布于我國(guó)四川、甘肅、青海、寧夏等地，為傳統(tǒng)的祛風(fēng)除濕中藥，以莖皮入藥。性溫、味辛、入肝腎經(jīng)，具有祛風(fēng)除濕、通關(guān)節(jié)、強(qiáng)筋骨之功效，主治風(fēng)寒濕痹、足膝無(wú)力等癥。紅毛五加含有多糖、苷類、揮發(fā)油、鞣質(zhì)、維生素A、維生素B等成分。其中多糖、苷類為其主要成分，苷類主要為刺五加苷類，尤以刺五加苷E、B為多。 既往的研究證實(shí)紅毛五加莖皮各種不同提取物分別具有增加冠

2、脈流量、改善心肌能量代謝、抗心律失常、解熱鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜催眠、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、保肝、抗病毒、抗炎等多種藥理作用，而且毒性較小。以前的研究多集中在紅毛五加多糖抗腫瘤等研究上，對(duì)多糖的抗腫瘤機(jī)制研究比較深入。然而，對(duì)紅毛五加抗炎的研究比較少，而且停留在動(dòng)物水平，對(duì)其抗炎的分子機(jī)制以及抗炎的成分研究很少。本課題組以前的研究已證實(shí)紅毛五加的醇提物對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞COX產(chǎn)生的PGE2有抑制作用。本研究在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用RAW264.7細(xì)胞所產(chǎn)生的

3、PGE2含量為篩選指標(biāo)，對(duì)紅毛五加抗炎有效成分進(jìn)行了萃取、分離，得到了兩個(gè)有效部分。并且初步探討純氯仿洗脫部分的抗炎作用機(jī)制。純氯仿洗脫部分能夠直接抑制COX-2的酶活性，而且純氯仿洗脫部位還可以抑制致炎介質(zhì)TNF-α以及NO的產(chǎn)生，但是不影響介質(zhì)IL-10的產(chǎn)生。同時(shí)，我們還探討了純氯仿洗脫部分對(duì)OVCAR3腫瘤細(xì)胞的作用。 本實(shí)驗(yàn)分為三部分第一部分：紅毛五加莖皮抗炎有效成分篩選目的：從紅毛五加莖皮中提取、分離、篩選抗炎有效成

4、分。 方法：1.紅毛五加莖皮粉碎，95％乙醇浸漬48h，濾取提取液，重復(fù)上述操作一次，合并提取液，減壓低溫回收溶劑，加水溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，合并正丁醇萃取部分，減壓低溫回收溶劑，真空低溫干燥。正丁醇萃取部分干燥物用甲醇溶解，濕法加入硅膠柱，依次用溶劑系統(tǒng)氯仿-甲醇(含甲醇O、5％、10％、20％、30％、50％、100％)洗脫，減壓低溫回收溶劑，真空低溫干燥。 2.以LPS刺激小鼠巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞RA

5、W264.7，立即加入紅毛五加各萃取部分、水相部分以及各分離部分共孵育24h，用放射免疫法測(cè)定細(xì)胞上清液中PGE2的含量，以能夠抑制LPS刺激RAW264.7產(chǎn)生PGE2的作用為抗炎指標(biāo)，逐步對(duì)紅毛五加提取物進(jìn)行篩選。 結(jié)果：1.得到白色微帶棕黃色的純氯仿洗脫部分0.3g，棕褐色的10％甲醇洗脫部分0.6g。 2.石油醚萃取部分在50mg/L劑量下不抑制細(xì)胞活性，而乙酸乙酯萃取部分、正丁醇萃取部分以及水相部分在100mg

6、/L下不抑制細(xì)胞活性。分離部分中純氯仿洗脫部分，20％甲醇洗脫部分在50mg/L劑量下不抑制細(xì)胞活性，其他洗脫部分在100mg/L下不抑制細(xì)胞活性。 3.RAW264.7細(xì)胞在LPS(1mg/L)刺激下產(chǎn)生PGE2為9.18±1.27pg/ml，正丁醇萃取部分的40mg/L以及10mg/L劑量對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生PGE2為7.26±0.95pg/ml、7.43±0.82pg/ml，與LPS刺激組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

7、(P＜0.05)，抑制率分別為23.7％、21.6％。萃取水相40mg/L劑量組對(duì)LPS刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生PGE2為7.18±1.46pg/ml，與LPS刺激組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，抑制率為24.7％。而其他萃取部分各劑量組與LPS刺激組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 4.RAW264.7細(xì)胞在LPS(1mg/L)刺激下產(chǎn)生PGE2為63.26±23.66pg/ml，純氯仿洗脫部分40mg/L組PG

8、E2為20.27±4.70pg/ml，10mg/L組PGE2為29.12±7.73pg/ml，與LPS刺激PGE2相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，抑制率分別為69.6％、55.0％。10％甲醇洗脫部分40mg/L組PGE2為20.48±9.41pg/ml，10mg/L組PGE2為21.00±9.68pg/ml，與LPS刺激組PGE2相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，抑制率分別為69.7％、68.4％。而其他部分各劑量組與LPS刺激

9、組相比均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 結(jié)論：紅毛五加抗炎的有效成分存在于其經(jīng)乙醇提取，正丁醇萃取后的純氯仿洗脫部分以及10％甲醇洗脫部分。 第二部分：紅毛五加抗炎作用機(jī)制的初步研究目的：初步研究從紅毛五加中篩選出的純氯仿洗脫部分的抗炎機(jī)制。 方法：1.培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，加入阿司匹林作用2h，抑制COX-1的表達(dá)，吸棄上清，加入新培養(yǎng)基，加入LPS刺激COX-2的表達(dá)20h，更換培養(yǎng)基，加入紅毛五加純氯仿

10、洗脫部分，孵育15min后加入花生四烯酸，15min后立即吸取上清液，用放免法測(cè)定PGE2，以判斷純氯仿洗脫部分是否可以直接抑制COX-2的活性。 2.LPS刺激RAW264.7細(xì)胞，加入純氯仿洗脫部分共孵育20h，酶聯(lián)免疫方法測(cè)定細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-10的含量以及硝酸還原酶法測(cè)定NO的含量。 結(jié)果：1.RAW264.7細(xì)胞在LPS(1mg/L)刺激下產(chǎn)生PGE2為121.68±16.95pg/ml，正常對(duì)照組

11、產(chǎn)生的PGE2為40.91±9.42pg/ml，塞來(lái)昔布組產(chǎn)生PGE2為66.51±12.54pg/ml，與LPS刺激組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。純氯仿洗脫部分40mg/L劑量組產(chǎn)生的PGE2為79.57±12.50pg/ml，與LPS刺激組相比，有顯著性差異(P＜0.01)，10mg/L劑量組產(chǎn)生的PGE2為95.20±11.20pg/ml，與LPS刺激組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，抑制率分別為52.1％、32.8％

12、。 2.RAW264.7細(xì)胞在LPS刺激下產(chǎn)生的TNF-α為530.6±15.4pg/ml，正常對(duì)照組產(chǎn)生的TNF-α為62.8±22.9pg/ml，DXM藥物組產(chǎn)生的TNF-α為132..3±26.0pg/ml，與LPS刺激組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。紅毛五加純氯仿洗脫部分40mg/L劑量組產(chǎn)生的TNF-α為291.6±40.7pg/ml，10mg/L劑量組產(chǎn)生的TNF-α為358.6±37.9pg/ml，與LPS刺

13、激組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，抑制率分別為51.0％，36.8％。 3.RAW264.7細(xì)胞LPS刺激下產(chǎn)生的IL-10為214.4±33.5pg/ml，干擾素(IFN)組產(chǎn)生的IL-10為824.7±26.6pg/ml，與LPS刺激組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。純氯仿洗脫部分40mg/L劑量組、10mg/L劑量組、產(chǎn)生的IL-10分別為229.4±39.0pg/ml、243.7±47.7pg/ml，與刺激組相

14、比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 4.RAW264.7細(xì)胞在LPS刺激下產(chǎn)生的NO為33.7±3.6μmol，陽(yáng)性藥物組NO為24.3±2.9μmol，與LPS刺激組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。純氯仿洗脫部分40mg/L劑量組NO為26.2±2.9μmol，與LPS刺激組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，氯仿洗脫部分10mg/L劑量組NO為28.3±3.2μmol，與LPS刺激組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，抑

15、制率分別為66.0％、47.0％。 結(jié)論：紅毛五加抗炎的部分機(jī)制與直接抑制COX-2的活性有關(guān)，而且可以抑制了炎癥細(xì)胞產(chǎn)生TNF-a、NO，但不促進(jìn)抑炎癥因子IL-10的產(chǎn)生。 第三部分：紅毛五加純氯仿洗脫部分對(duì)腫瘤細(xì)胞的促凋亡作用目的：探討純氯仿洗脫部分是否對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用。 方法：分別采用MTT法、形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞術(shù)方法檢測(cè)純氯仿洗脫部分對(duì)腫瘤細(xì)胞OVCAR3的促凋亡作用。 結(jié)果：MTT法可