刺五加水提物抗炎作用及其機(jī)制研究.pdf

1、刺五加在我國(guó)作為一種傳統(tǒng)藥物應(yīng)用已有悠久歷史。目前，刺五加在國(guó)內(nèi)外主要應(yīng)用于冠心病、心絞痛、缺血性中風(fēng)、糖尿病和高血壓等疾病的治療，而在刺五加抗炎作用及機(jī)制方面鮮見(jiàn)報(bào)道。本論文采用小鼠巨噬細(xì)胞炎癥模型和小鼠內(nèi)毒素休克模型，研究了刺五加水提物抗炎作用及其機(jī)制。具體實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與結(jié)果如下： 1．刺五加水提物分別與活化的 RAW264.7 小鼠巨噬細(xì)胞和原代培養(yǎng)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞共同培養(yǎng)，采用 Griess 試劑、NBT 還原法、酚紅氧化

2、法、ELISA 方法和中性紅吞噬法檢測(cè)了巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 NO、O<,2>、H<,2>O<,2> 和 TNF-α的含量及細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，刺五加水提物在 10～1000 μg/mL 范圍內(nèi)顯著抑制了 LPS&IFN-γ誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO，ZYM誘導(dǎo)產(chǎn)生的O<,2>和PMA誘導(dǎo)產(chǎn)生的H<,2>O<,2>，對(duì) LPS&IFN-γ誘導(dǎo)產(chǎn)生的 TNF-α無(wú)顯著影響，細(xì)胞活力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明這些抑制作用不是細(xì)胞毒性作用的結(jié)果。為了在整體動(dòng)物水平

3、上證實(shí)刺五加水提物對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)的抑制作用，我們給小鼠腹腔注射刺五加水提物，分離腹腔巨噬細(xì)胞，分別檢測(cè)巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 NO、O<,2><'->、H<,2>O<,2>及 TNF-α的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，100 和 200 mg/kg 劑量的刺五加水提物明顯抑制了小鼠腹腔巨噬細(xì)胞在 LPS&IFN-γ誘導(dǎo)刺激下產(chǎn)生的 NO，ZYM 誘導(dǎo)刺激下產(chǎn)生的 O<,2><'->和 PMA 誘導(dǎo)刺激下產(chǎn)生的 H<,2>O<,2>，對(duì)

4、LPS&IFN-γ誘導(dǎo)產(chǎn)生的 TNF-α無(wú)顯著影響。上述結(jié)果提示刺五加水提物可能通過(guò)抑制活化巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)發(fā)揮其抗炎功效。 2．NO 在炎癥發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中有著重要的作用，刺五加水提物明顯抑制了 NO 的產(chǎn)生，因此我們進(jìn)一步深入探討了刺五加水提物抑制 NO 產(chǎn)生的作用機(jī)制。分別采用Real-Time RT-PCR 方法檢測(cè) iNOS mRNA 水平，Western blotting 方法檢測(cè) iNOS、NF-κBp65

5、和 NF-κB 抑制蛋白 I-κBα蛋白的表達(dá)，ELISA 方法檢測(cè) NF-κB p65 與 DNA 的結(jié)合活性和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)胞內(nèi) ROS 的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，刺五加水提物抑制了RAW264.7 小鼠巨噬細(xì)胞在 LPS&IFN-γ誘導(dǎo)刺激下，iNOS 的 mRNA 和蛋白表達(dá)水平，NF-κB p65 的核轉(zhuǎn)位、I-κBα的降解，以及 NF-κB p65 與 DNA 的結(jié)合活性和胞內(nèi) ROS的產(chǎn)生。表明刺五加水提物通過(guò)阻斷 NF-κ

6、B 細(xì)胞信號(hào)通路的活化，抑制 iNOS 的基因表達(dá)，最終抑制了 NO 的產(chǎn)生。 3．我們建立了 LPS/D-GalN 誘發(fā)的小鼠內(nèi)毒素休克模型，研究刺五加水提物對(duì)小鼠內(nèi)毒素休克的保護(hù)作用及其機(jī)制。存活率觀察結(jié)果顯示，100、200 和400 mg/kg 劑量的剌五加水提物預(yù)防組顯著提高了小鼠的存活率，而 200、400 和 800 mg/kg 劑量的刺五加水提物治療組小鼠的存活率無(wú)明顯提高，提示刺五加水提物對(duì)內(nèi)毒素休克有預(yù)防作用

7、。我們進(jìn)一步檢測(cè)了刺五加預(yù)防組小鼠血清和肝臟中相關(guān)炎癥介質(zhì)水平，研究刺五加水提物對(duì)內(nèi)毒素休克的預(yù)防保護(hù)機(jī)制。采用 Griess 試劑檢測(cè)血清中 NO 的含量；ELISA方法檢測(cè)血清和肝臟中 TNF-α和IL-10 的含量；Western blotting 方法檢測(cè)肝臟中 iNOS的表達(dá)水平；ELISA 方法檢測(cè) NF-κB p65 與 DNA 的結(jié)合活性；HE 染色檢測(cè)主要器官的病理情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，刺五加水提物顯著抑制了血清和肝臟中

8、 TNF-α和 NO 的產(chǎn)生，以及肝臟中 iNOS 的表達(dá)和 NF-κB p65 與 DNA 的結(jié)合活性，提高了血清和肝臟中IL-10 水平，減輕了心臟、肝臟和肺主要器官炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，病理?yè)p傷情況明顯改善。表明刺五加水提物通過(guò)提高 IL-10 水平和抑制 NF-κB 的活性，降低了 TNF-α和 NO 的釋放，減輕了重要臟器的炎癥損傷，從而發(fā)揮其對(duì)內(nèi)毒素休克的保護(hù)作用。綜上所述，本研究證實(shí)了刺五加水提物對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥介質(zhì)具有抑制作用以及