頭花蓼抗炎化學(xué)成分群以及抗炎作用的研究.pdf

1、頭花蓼為貴州著名的苗族用藥，其在臨床上對(duì)泌尿系統(tǒng)的感染有著顯著的療效。但國內(nèi)外對(duì)其研究報(bào)道不多，且主要集中在對(duì)其化學(xué)成分的分離研究和臨床藥理研究。而對(duì)其抗炎有效部位的探索和具體的作用機(jī)理在國內(nèi)外研究尚屬空白。本研究旨在通過研究頭花蓼水提物對(duì)LPS誘導(dǎo)顯著升高的三個(gè)抗炎因子NO,TNF-α，PG2的影響，從分子機(jī)制上探索其抗炎作用并初步推測(cè)其所作用的抗炎通路。本研究還建立了HPLC方法對(duì)頭花蓼水提物中的各有效成分的組成和含量進(jìn)行測(cè)定，并通

2、過HSCCC分離出兩個(gè)有效成分單體并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。從而為進(jìn)一步探索分離頭花蓼中的有效抗炎成分打下了良好的基礎(chǔ)。
　　 一.頭花蓼水提物對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的細(xì)胞毒性研究。
　　 本研究選用小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7做為建立炎癥模型的細(xì)胞。利用MTT法測(cè)定頭花蓼不同濃度的水提取物對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的細(xì)胞毒性，結(jié)果證明300mg/ml以下的頭花蓼水提物對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7沒有明顯的細(xì)胞毒

3、性，且其IC50＞該實(shí)驗(yàn)的最高濃度(500mg/ml).
　　 二.LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥模型建立。
　　 查閱相關(guān)文獻(xiàn)，LPS對(duì)于炎癥因子TNF-α，PG2的誘導(dǎo)濃度是一致的，而LPS對(duì)于炎癥因子NO的誘導(dǎo)濃度有不同的報(bào)道，本研究擬通過檢測(cè)不同濃度LPS對(duì)NO誘導(dǎo)的效果，從而確定其最佳的誘導(dǎo)濃度。經(jīng)過檢測(cè)，10μg/ml的LPS對(duì)NO的誘導(dǎo)效果最好，能顯著增加NO含量達(dá)到274.9％，所以以此濃度做為L(zhǎng)P

4、S誘導(dǎo)NO升高的最佳濃度。
　　 三.頭花蓼對(duì)LPS誘導(dǎo)的抗炎因子升高的作用。
　　 本研究分別選擇NO，TNF-α，PG2三個(gè)典型的炎癥因子做為頭花蓼抗炎作用的檢測(cè)指標(biāo)，并檢測(cè)不同濃度的頭花蓼水提液對(duì)LPS誘導(dǎo)的這三個(gè)炎癥因子升高的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的頭花蓼水提物對(duì)LPS誘導(dǎo)的NO，TNF-α，PG2升高均有良好的抑制作用，且其效果呈劑量依賴性，其抗炎作用與頭花蓼臨床實(shí)驗(yàn)所得出的抗炎結(jié)果是吻合的。而頭花蓼水提

5、物低濃度對(duì)PG2的抑制作用要好于其對(duì)NO，TNF-α的抑制作用。初步推測(cè)其抗炎作用靶點(diǎn)可能在花生四烯酸的代謝途徑上，需要進(jìn)一步的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)來論證。
　　 四.頭花蓼HPLC分析方法的建立和各主要化學(xué)成分在頭花蓼水提液中的組成。
　　 本研究建立了簡(jiǎn)單，快捷，靈敏的HPLC分析方法，HPLC方法為：以VenusilMPC18(250×4.6mm，5μm)色譜柱為固定相；流動(dòng)相：A為水-N，N-二甲基甲酰胺-冰醋酸(81

6、∶15∶3)，B為色譜甲醇，梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?～30min，95％A-30％A，5％B-70％B30～40min，30％A，70％B；40～43min，30％A-95％A，70％B-5％B；43～48min，95％A，5％B。檢測(cè)波長(zhǎng)為272nm，流速為0.5mL/min，柱溫為室溫，進(jìn)樣量為10μL。在此方法下可以在55min的分析時(shí)間里使頭花蓼的有效成分達(dá)到有效的分離。并通過此方法進(jìn)行頭花蓼水提物中各有效成分的含量檢測(cè)，而其中

7、沒食子酸、原兒茶酸、短葉蘇木酚酸、槲皮苷、槲皮素分別占頭花蓼原粉的2.07％、0.13％、0.15％、0.65％、0.06％。
　　 五.頭花蓼提取工藝的優(yōu)化。
　　 本研究通過利用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇四種不同極性的溶劑對(duì)頭花蓼水提物進(jìn)行萃取，并通過HPLC對(duì)萃取液進(jìn)行分析，結(jié)果顯示乙酸乙酯對(duì)頭花蓼中的主要化學(xué)成分富集作用最為明顯。將頭花蓼乙酸乙酯提取物作為HSCCC分離頭花蓼有效成分單體的原料。
　　

8、 六.高速逆流色譜分離頭花蓼水提物的有效成分。
　　 本研究應(yīng)用高速逆流色譜法對(duì)頭花蓼水提物的乙酸乙酯粗提物的化學(xué)成分進(jìn)行了半制備性分離研究，通過對(duì)分離方法和溶劑系統(tǒng)的篩選，尋找到最佳的溶劑系統(tǒng)(正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶水=1∶5∶1∶5)，上相為固定相，轉(zhuǎn)速840r/m流速2.0mL/min，進(jìn)樣量756mg，檢測(cè)波長(zhǎng)272nm。結(jié)果顯示，在該條件下經(jīng)一步分離可同時(shí)得到純度為99.8％和97.4％的兩種產(chǎn)物，經(jīng)紫外、紅外、質(zhì)譜