瑤藥石柑子的化學(xué)成分及抗炎活性研究.pdf

1、目的:
　　石柑子Pothos chinensis(Raf.) Merr為天南星科Pothos石柑屬Araceae一年生草本植物，為傳統(tǒng)瑤醫(yī)老班藥“十八鉆”之一的葫蘆鉆，瑤族民間常用于治療各種“腫癥”。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，目前，對(duì)石柑子的藥理研究多集中在抗腫瘤、抗氧化等方面，抗炎作用研究報(bào)道還很少見(jiàn)，且未見(jiàn)對(duì)石柑子的不同提取物及有效成分抗炎活性方面研究報(bào)道。本課題采用體外細(xì)胞模型篩選其有效部位，尋找作用通路及靶點(diǎn);同時(shí)，綜合運(yùn)用現(xiàn)代先進(jìn)的

2、分離手段及技術(shù)對(duì)石柑子有效部位的化學(xué)成分進(jìn)行分離，獲得有效成分單體，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步篩選具有抗炎活性的化合物，進(jìn)而闡明其化學(xué)成分的抗炎作用機(jī)制，為瑤藥石柑子的合理開(kāi)發(fā)利用奠定技術(shù)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.石柑子不同部位的提取
　　采用甲醇冷浸提取，減壓回收甲醇提取液，干燥后的浸膏用適量水分散，先后用不同極性的溶劑萃取，分別得到石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水五個(gè)部位提取物。
　　2.有效部位的抗炎活性篩選

3、
　　采用LPS刺激的RAW264.7炎癥細(xì)胞模型分別對(duì)石柑子石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水部位的提取物進(jìn)行抗炎活性篩選。采用MTT法檢測(cè)不同提取物對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力的影響，采用RT-qPCR法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞中iNOS和COX-2的mRNA表達(dá)以及采用Western blot法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞中iNOS和COX-2蛋白的表達(dá)。
　　3.有效部位化學(xué)成分的分離純化
　　采用系統(tǒng)分離法，綜

4、合運(yùn)用正反相硅膠柱色譜、微孔樹(shù)脂柱色譜、Sephadex LH-20柱色譜和C18反相硅膠高壓制備色譜以及重結(jié)晶等分離純化方法對(duì)石柑子的有效部位進(jìn)行分離純化，獲得有效部位單體，并結(jié)合ESI-MS、EI-MS、1H-NMR、13C-NMR等波譜分析方法對(duì)所得化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。
　　4.有效部位化學(xué)成分的抗炎活性篩選
　　采用LPS刺激的RAW264.7和NF-κB高表達(dá)RAW264.7細(xì)胞炎癥模型對(duì)石柑子中分離所得化合物的抗

5、炎活性進(jìn)行篩選。采用MTT法檢測(cè)不同濃度化合物對(duì)RAW264.7NF-κB高表達(dá)RAW264.7細(xì)胞活力的影響;采用熒光素酶標(biāo)記法測(cè)定LPS誘導(dǎo)的NF-κB高表達(dá)RAW264.7細(xì)胞的熒光釋放量及采用Griess法檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞上清液中NO的釋放量。實(shí)現(xiàn)對(duì)有效成分化合物抗炎活性的快速篩選。
　　結(jié)果:
　　1.從石柑子藥材中提取得到石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水五個(gè)不同極性的提取物。
　　2.石柑子的

6、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水提取物作用于RAW264.7細(xì)胞的安全劑量分別為不大于25.00，6.25，12.50，25.00，25.00μg/mL;石油醚提取物在濃度為25.00μg/mL時(shí)能下調(diào)RAW264.7細(xì)胞中iNOS mRNA表達(dá)且抑制iNOS的蛋白表達(dá);三氯甲烷提取物在濃度為6.25 tg/mL時(shí)能下調(diào)RAW264.7細(xì)胞中COX-2mRNA表達(dá)且抑制COX-2的蛋白表達(dá)。
　　3.從石柑子的三氯甲烷提取物

7、中分離得到16個(gè)化合物，分別鑒定為Aurantiamide Acetate、N-反式香豆酰酪胺、N-反式阿魏酰酪胺、芥酸酰胺、E-4-hydroxyhex-2-enoic acid、壬二酸、葵二酸、9(S)，12(S)，13(S)-Trihydroxyoctadeca-10(E)，15(Z)-dienoicacid、丁香酸、香草酸、19α-羥基熊果酸、毛冬青素A、(9E)-8，11，12-三羥基-十八烯酸甲酯、富馬酸單甲酯、豆甾醇和對(duì)羥

8、基苯甲醛;其中，有11個(gè)為首次從該植物中分離得到，分別為:Aurantiamide Acetate、(9E)-8，11，12-三羥基-十八烯酸甲酯、9(S)，12(S)，13(S)-Trihydroxyoctadeca-10(E)，15(Z)-dienoic acid、芥酸酰胺、19α-羥基熊果酸、豆甾醇、毛冬青素A、富馬酸單甲酯、壬二酸、葵二酸、E-4-hydroxyhex-2-enoic acid。
　　4.在安全濃度范圍內(nèi)，

9、Aurantiamide Acetate對(duì)NF-κB的活性具有抑制作用，并能減少NO的生成。
　　結(jié)論:
　　通過(guò)體外細(xì)胞模型快速篩查，發(fā)現(xiàn)石柑子石油醚提取物、三氯甲烷提取物對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥具有保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制與抑制iNOS和COX-2的基因及蛋白表達(dá)有關(guān)。從石柑子三氯甲烷提取物中分離鑒定出16個(gè)化合物，其中化合物Aurantiamide Acetate可能是通過(guò)調(diào)控NF-κB炎癥通路，抑制NF-κ