不同潮氣量機(jī)械通氣大鼠血清對血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣激活鉀通道的影響.pdf

1、目前,呼吸機(jī)的應(yīng)用在大中型醫(yī)院已經(jīng)得到普及,已成為搶救危重病患者最重要的儀器之一。但隨著呼吸機(jī)使用的增加,呼吸機(jī)本身引起的肺損傷(VentilationInducedLungInjury,VILI)的發(fā)生率也逐年升高。據(jù)最新統(tǒng)計(jì),VILI的發(fā)生率在機(jī)械通氣患者中可高達(dá)15％。因此,深入研究VILI的發(fā)病機(jī)制,并篩選防治VILI的有效藥物是臨床上,迫切需要解決的問題。對于VILI的研究經(jīng)歷了氣壓傷、容量傷、剪切傷和生物傷的過程。目前認(rèn)為,

2、VILI的發(fā)生是多種因素共同作用的結(jié)果,既有機(jī)械力對肺組織細(xì)胞的直接損傷作用,也有機(jī)械力激活中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞,產(chǎn)生各種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì),進(jìn)而引起肺組織的損傷。
　　 血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)是VILI發(fā)病機(jī)制中重要的靶細(xì)胞之一。EC的凋亡或功能缺損直接影響肺血管內(nèi)皮一肺泡上皮的屏障功能,引起肺微血管通透性增高,從而導(dǎo)致肺水腫。而EC離子通道在調(diào)節(jié)細(xì)胞功能上發(fā)揮重要作用,本實(shí)驗(yàn)正是通過研究VILI大鼠血清對EC鈣激活鉀

3、(Kca)通道的影響,從而探討ECKca通道在’VILI發(fā)病中的作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)分為兩部分:
　　 第一部分:改良的適合膜片鉗試驗(yàn)的血管內(nèi)皮細(xì)胞處理和ECV304細(xì)胞Kca通道的鑒定。
　　 方法:采用改良的一次貼壁法,通過在對細(xì)胞的消化過程中,控制胰酶的量、濃度以及消化時(shí)間來尋找適合膜片鉗實(shí)驗(yàn)的EC細(xì)胞半貼壁狀態(tài),用單通道法記錄Kca通道電流并進(jìn)行鑒定。
　　 結(jié)果:倒置顯微鏡下觀察,可見ECV30

4、4呈不規(guī)則多邊形,核圓,核膜清晰,當(dāng)細(xì)胞匯融成單細(xì)胞層時(shí),呈鋪路石樣排列,消化后的半貼壁細(xì)胞相比鋪路石樣的貼壁細(xì)胞,形態(tài)為橢圓形,且直徑縮小,厚度增大。
　　 在細(xì)胞貼附式條件下,當(dāng)細(xì)胞浴液Ca2+離子濃度為2mmol/L時(shí),給予鉗制電壓未記錄到任何電流活動(dòng)。改變浴液使Ca2+離子濃度為22mol/L,給予同樣的鉗制電壓可明顯激活細(xì)胞通道電流,該電流隨著鉗制電壓的增大而增大,呈現(xiàn)良好的電壓依賴性。根據(jù)電流曲線圖推算出該通道電導(dǎo)為

5、189pS,反轉(zhuǎn)電位接近0mV,符合大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(BKca通道)特性。往細(xì)胞浴液中加入鉀通道抑制劑TEA(1mmol/L)可使該通道活動(dòng)完全抑制,可證實(shí)該電流為鈣依賴性鉀離子電流。
　　 結(jié)論:采用這種改良的方法,在細(xì)胞的消化過程中避免了吹打及離心,對細(xì)胞膜損傷較小,也保證了實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的良好狀態(tài),并且能在較短的時(shí)間內(nèi)完成膜片鉗實(shí)驗(yàn),根據(jù)對ECKca通道的鑒定,證實(shí)了該方法是一種適合膜片鉗實(shí)驗(yàn)的EC細(xì)胞處理方法。
　　

6、 第二部分:不同潮氣量大鼠血清對內(nèi)皮細(xì)胞鈣激活鉀通道的影響。
　　 方法:24只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為A、B、C三組,每組8只,麻醉后氣管切開、插管,分別給予不同潮氣量機(jī)械通氣4小時(shí)(A組:對照組,不通氣；B組:VT=10ml/kg；C組:VT=40ml/kg),通氣結(jié)束后從腹主動(dòng)脈抽血,離心得血清,分別作用于體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系ECV304細(xì)胞0.5小時(shí),并利用膜片鉗技術(shù)觀察各細(xì)胞Kca通道的電流變化。
　　

7、 結(jié)果:C組大鼠有1只在通氣1h左右死亡,A組及B組大鼠在機(jī)械通氣結(jié)束后無死亡。通氣結(jié)束后開胸取出心肺,A組大鼠肺組織呈粉紅色,B組大鼠肺組織呈鮮紅色,邊緣可見輕度水腫,C組大鼠肺組織明顯充血水腫,呈暗紅色。A組大鼠血清刺激內(nèi)皮細(xì)胞0.5小時(shí)后細(xì)胞未見明顯變化；B組大鼠血清刺激內(nèi)皮細(xì)胞0.5h后,可見細(xì)胞稍有收縮,細(xì)胞間距稍增大；C組大鼠血清刺激內(nèi)皮細(xì)胞0.5h后,可見細(xì)胞間距增大,部分細(xì)胞邊界開始出現(xiàn)模糊。A組血清刺激的細(xì)胞給予鉗制電

8、壓未記錄到任何電流活動(dòng)；B、C組細(xì)胞可記錄到BKca通道電流活動(dòng),且在相同的測試電壓下,C組細(xì)胞的電流幅值以及開放概率與B組細(xì)胞的電流幅值以及開放概率有顯著性差異(P<0.001)。
　　 結(jié)論:大潮氣量機(jī)械通氣可導(dǎo)致血液中炎癥介質(zhì)的釋放,并使EC收縮,屏障功能損害,且使EC細(xì)胞Kca通道開放率增加,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)超極化作用增強(qiáng),增加電化學(xué)驅(qū)動(dòng)力而使鈣內(nèi)流增加,細(xì)胞內(nèi)概離子濃度持續(xù)升高,鈣離子是參與調(diào)節(jié)機(jī)械牽張誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)