tmTNF-α殺傷效應的分子機制及其與脂筏的關系.pdf

1、TNF-α是一種具有多種生物學活性的細胞因子，以26kDa膜蛋白的形式表達于細胞膜表面（transmembrane tumor necrosis factor,tmTNF-α），在金屬基質蛋白酶或其它酶類的作用下剪切為17 kDa的可溶性分子（secret tumor necrosis factor, sTNF-α），參與細胞的凋亡，增殖和分化。兩型TNF-α通過其特異性受體（TNFR1和TNFR2）介導生物學活性，而tmTNF-α與T

2、NFR2親和力高于sTNF-α，二者生物學效應不盡相同。
　　本課題組前期工作以及國外的研究表明,在抗腫瘤方面，tmTNF-α可殺傷對sTNF-α耐受的腫瘤細胞株，其殺瘤譜更廣：前者主要誘導凋亡，后者主要誘導壞死。tmTNF-α在體內可促進腫瘤細胞表達Fas，通過FasL/Fas途徑殺傷腫瘤；而sTNF-α則主要通過誘導淋巴細胞浸潤，促進抗腫瘤免疫發(fā)揮效應。tmTNF-α與受體結合后，可通過受體介導的正向信號抑制NF-kB，誘導腫

3、瘤細胞凋亡；但是腫瘤細胞自身高表達tmTNF-α則可通過反向信號引起NF-kB活化,促進細胞存活，抵抗凋亡刺激信號。由此可見TNF-α的膜分子與其可溶性分子在生理和病理生理作用上可能存在很大差異。
　　TNFR1信號傳導通路的分子機理已了解得十分清楚。但是，tmTNF-α如何啟動TNFR2凋亡信號轉導途徑尚不清楚。且兩型TNF-α生物學活性差異的分子機制是什么?也是亟待研究和解決的問題。
　　本研究上篇旨在比較兩型TNF-α

4、通過TNFR2信號通路介導的細胞凋亡和生存信號的差異及其分子機制，下篇則探討脂筏在兩型TNF-α通過TNFR1殺傷效應中的作用及其機制，該研究不但深入闡明兩型TNF-α的生物學功能及其分子機制，而且為抗腫瘤治療提供新的分子靶點和干預線索。
　　上篇比較兩型TNF-α通過TNFR2誘導細胞凋亡和生存信號的差異其主要研究結果如下：
　　一、兩型TNF-α通過TNFR2誘導細胞凋亡或生存
　　1.效應細胞和靶細胞的選擇

5、>　　流式細胞儀檢測細胞表面膜蛋白表達率分別為：穩(wěn)轉人tmTNF-α的NIH3T3細胞系表面tmTNF-α表達率為47.7％，可作為表達tmTNF-α的效應細胞；HL-60細胞TNFR2表達量高，而TNFR1表達量低，故用該細胞作為靶細胞，研究TNFR2信號通路。
　　2．兩型TNF-α對HL-60細胞的殺傷效應不同
　　兩型TNF-α通過TNFR2對腫瘤細胞產生死亡或生存效應，tmTNF-α通過TNFR2促使腫瘤細胞凋亡，

6、而sTNF-α則通過TNFR2介導腫瘤細胞的生存。
　　3.兩型TNF-α對HL-60細胞周期的影響
　　tmTNF-α組可使G2期的細胞數(shù)下降，但與之相比，G1細胞下降更為明顯，降低61％；而sTNF-α組S期與control相比略有下降，但無顯著差異。這一結果表明，tmTNF-α主要誘導G1期細胞凋亡。
　　4.蛋白合成對兩型TNF-α效應的影響不同
　　與對照組相比，tmTNF-α可有效殺傷HL-60，其殺

7、傷率79％，加入蛋白合成抑制劑放線菌酮可明顯抑制tmTNF-α對HL-60細胞的殺傷。sTNF-α對HL-60無明顯殺傷，加入放線菌酮使sTNF-α對HL-60的胞毒作用敏感性增加，其殺傷率為38％。提示tmTNF-α的胞毒作用需要依賴蛋白質合成，而sTNF-α與tmTNF-α完全不同，其殺傷靶細胞需要抑制蛋白合成。
　　5.轉染TNFR1 siRNA對tmTNF-α殺傷HL-60細胞無影響
　　轉染TNFR1 siRNA與

8、未轉染組相比，對tmTNF-α的殺傷效應無明顯影響， tmTNF-α仍然可有效地殺傷HL-60，其殺傷率為77％（***p<0.001.vs NIH3T3）。這一結果提示TNFR1不介導tmTNF-α對HL-60細胞的殺傷。
　　6.轉染TNFR2 siRNA可顯著降低tmTNF-α對HL-60細胞的殺傷
　　未轉染組中，tmTNF-α可有效地殺傷HL-60，其殺傷率為63％（***p<0.001.vs NIH3T3），而s

9、TNF-α卻無殺傷作用。但是，當轉染了TNFR2 siRNA后，tmTNF-α的殺傷效應顯著降低（***p<0.001.vs tmTNF-α/NIH3T3），而對sTNF-α則無影響。該結果表明tmTNF-α對HL-60的殺傷主要依賴TNFR2信號轉導途徑。
　　二、tmTNF-α通過TNFR2募集死亡信號，解離生存信號
　　我們前期工作利用TNFR2抗體進行IP-Western，證實tmTNF-α通過TNFR2募集FADD

10、、RIP與caspase8等死亡信號，而sTNF-α則通過TNFR2募集TRAF1、TRAF2、TRAF3、cIAP1、cIAP2和cFLIP等抗凋亡和生存信號，但是，tmTNF-α卻導致這一生存信號的喪失。我們假設tmTNF-α導致某些接頭分子的降解，進而使生存信號與TNFR2解離。
　　1. tmTNF-α通過TNFR2使TRAF2與cIAP-1發(fā)生泛素化而被降解
　　2. tmTNF-α通過TNFR2抑制抗凋亡分子cF

11、LIP合成
　　3. tmTNF-α通過TNFR2介導NF-κB失活，而sTNF-α則通過TNFR2介導NF-κB的經典和非經典途徑的活化
　　下篇脂筏在兩型TNF-α通過TNFR1殺傷效應中的作用及其機制
　　其主要結果如下：
　　一、脂筏可促進tmTNF-α的胞毒效應，卻抑制sTNF-α的殺傷作用
　　二、脂筏抑制sTNF-α殺傷作用的機制
　　1.脂筏下調sTNF-α在胞漿內通過TNFR1募集D

12、ISC死亡信號，促進sTNF-α在胞膜上通過TNFR1募集TRAF2和RIP1等生存信號
　　2.脂筏阻止sTNF-α誘導caspase8和caspase3的活化
　　三、脂筏促進tmTNF-α胞毒效應的機制：
　　1.脂筏促進tmTNF-α對caspase8和caspase3的活化
　　2.脂筏外TRAF2可部分拮抗tmTNF-α的殺傷作用
　　3.脂筏外TRAF2可抑制tmTNF-α誘導的DISC信號<