脂筏調(diào)控GABAB受體轉激活IGF-1受體的機制研究.pdf

1、G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein-coupled receptors,GPCRs)作為重要的跨膜蛋白,其結構和功能受與之相互作用的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)分子調(diào)控。脂筏是細胞膜上富含特殊脂質(zhì)與蛋白質(zhì)的微結構域,能夠作為平臺組織特異的GPCRs信號復合體,并調(diào)控其信號轉導的效率與特異性。大部分GPCRs通過棕櫚?；揎椂ㄎ辉谥ぶ?并受棕櫚酰轉移酶與硫酯酶的可逆性雙重調(diào)控,與受體活性及生理狀態(tài)密切相關。GPCRs棕櫚?；揎梽恿W過程對其胞內(nèi)轉運及

2、膜上側向分選的影響是當前的研究熱點。
　　GABABR是C族GPCRs的重要成員之一,通過GB1與GB2兩個亞基形成的異源二聚體來行使功能。研究發(fā)現(xiàn)在小腦顆粒神經(jīng)元中,GABABR通過轉激活IGF-1R介導神經(jīng)保護功能?；诨钚缘男》肿庸饷籼结?ABPP)垂釣發(fā)現(xiàn)GABABR轉激活IGF-1R所誘導的不同信號蛋白的磷酸化需要形成一個大的蛋白質(zhì)復合物,復合物中不同蛋白的時空變化如G蛋白的釋放和受體酪氨酸激酶IGF-1R的結合對GAB

3、ABR誘導的相關生理學效應至關重要。另一方面,研究證實GABABR在靜息狀態(tài)下定位在脂筏中,激活后則轉運出脂筏。脂筏在GABABR轉激活IGF-1R過程中扮演什么角色,GABABR信號復合體的時空變化與脂筏有何相關性,GABABR在脂筏中的定位機制及調(diào)控因素是什么,迄今為止還沒有相關研究。
　　本文以過表達的HEK293細胞和原代培養(yǎng)的小鼠小腦顆粒神經(jīng)元細胞作為模式細胞,首先通過MCD破壞脂筏結構的完整性,發(fā)現(xiàn)GABA或Baclo

4、fen誘導的IGF-1R的磷酸化水平顯著下降。進一步通過?；锼亟粨Q(ABE)實驗發(fā)現(xiàn)GB2亞基C末端第874位的半胱氨酸發(fā)生棕櫚?；揎?GB2-C874A突變體在脂筏中的定位顯著下降。在保持脂筏完整性的前提下,通過突變棕櫚?；揎椘茐腉ABABR在脂筏中的定位導致GABA誘導的IGF-1R磷酸化水平-處理時間曲線發(fā)生顯著遷移。隨后通過抗去垢劑抽提的蔗糖密度梯度離心技術檢測GABABR激活后信號復合體的主要組分在脂筏及非脂筏區(qū)域的定

5、位變化,發(fā)現(xiàn)野生型GABABR與GB2-C874A突變體在激活后在脂筏內(nèi)外的運動趨勢存在顯著差異。最后,通過生物素標記的ABPP垂釣發(fā)現(xiàn)脂筏對于GABABR信號復合體成員的時空變化有重要影響,用MCD破壞脂筏會阻滯G蛋白的釋放,并破壞IGF-1R的結合。
　　上述研究表明脂筏是GABABR轉激活IGF-1R信號復合體在膜上的反應平臺,完整的脂筏結構以及GABABR在脂筏區(qū)域的正常定位是該信號復合體行使正常功能所必須的;在轉激活過程