tmTNF-α啟動TNFR2凋亡信號轉(zhuǎn)導的研究.pdf

1、腫瘤壞死因子-α（TNF-α），是一個多功能的細胞因子，參與各種不同的細胞活動，其中包括誘導其他細胞因子的產(chǎn)生，細胞的增殖、分化和凋亡。TNF-α首先被合成26 kDa的膜結(jié)合因子（跨膜腫瘤壞死因子-α，tmTNF-α），在金屬蛋白酶或其他酶類的作用下，從細胞膜外表面被剪切為17 kDa的可溶性分子（分泌型腫瘤壞死因子-α，sTNF-α）。兩型TNF-α以不同親和力與TNFR1和TNFR2結(jié)合而發(fā)揮生物學功能。
　　 細胞骨架蛋

2、白Actin已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在多種信號傳導通路中起著重要的調(diào)節(jié)作用，其中包括sTNF-α介導的細胞死亡。但是，Actin是否參與tmTNF-α介導的細胞胞毒作用尚不清楚。本實驗室首次發(fā)現(xiàn)tmTNF-α在殺傷靶細胞HL-60的時候，可和Actin發(fā)生免疫共沉淀。故本研究的上篇以HL-60為靶細胞，探討tmTNF-α殺傷信號和靶細胞骨架蛋白Actin之間的關系。下篇以HepG2細胞為模型，研究tmTNF-α誘導TNFR2凋亡信號復合物的形成，為干

3、預臨床腫瘤探尋新的分子靶點。
　　 上篇：骨架蛋白Actin參與tmTNF-α殺傷信號的研究
　　 主要實驗結(jié)果如下：
　　 一.CytD對Actin聚合的影響：在不同的時間點使用非中毒劑量的CytD（2 mM）來處理HL-60細胞，激光共聚焦圖像顯示，在對照組細胞中，Actin主要分布于細胞核周圍以及細胞膜下。但是隨著CytD作用時間的延長，Actin明顯分散于細胞胞漿中，且細胞熒光強度高于對照組細胞。

4、　　 二.CytD預先作用靶細胞時間對tmTNF-a殺傷作用的影響：采用MTT方法檢測發(fā)現(xiàn)，tmTNF-的細胞胞毒作用隨著CytD預處理時間的延長而降低。在CytD預作用120 min時，其對Actin的聚合和tmTNF-α介導的細胞胞毒作用的抑制強度最大，故后續(xù)實驗均采用2mM CytD預處理2小時。使用特異性抗體中和tmTNF-α的作用，完全抑制了這種膜分子的細胞毒效應。
　　 三.Actin解聚抑制了tmTNF-α介導的

5、細胞凋亡。
　　 四.TNFR１和TNFR2抗體交叉反應的鑒定：采用Western方法檢測發(fā)現(xiàn)，抗TNFR1的單克隆抗體只能檢測到人sTNFR1和HL-60細胞中的TNFR1，而抗TNFR2的單克隆抗體只能檢測到人sTNFR2和HL-60細胞中的TNFR2。提示這兩種抗TNFR1和抗TNFR2的單克隆抗體不存在交叉反應，可以用于后續(xù)的免疫共沉淀實驗。
　　 五.Actin解聚影響TNF-α介導的信號轉(zhuǎn)導，結(jié)果提示Acti

6、n參與兩型TNF-α不同的信號通路，且主要與TNFR2相關。
　　 六.tmTNF-α介導的TNFR2與Actin的相互作用可以被CytD阻斷：采用免疫共沉淀方法檢測證實，Actin可少量與TNFR1發(fā)生免疫共沉淀，且各處理因素對之無影響。相反，tmTNF-α可明顯增加Actin與TNFR2共沉淀的量，然而，用CytD促進Actin解聚則完全阻斷了tmTNF-α誘導的Actin與TNFR2的結(jié)合。提示Actin主要通過TNFR2

7、而不是TNFR1來參與tmTNF-α介導的調(diào)亡信號轉(zhuǎn)導途徑。
　　 七.Actin解聚對TNF及其受體表達的影響：采用FCM檢測證實，CytD的預處理導致該細胞TNFR2表達明顯降低，但對TNFR1的表達卻并無影響。由于Actin解聚對細胞裂解物中TNFR2的總量并無影響，提示Actin可能影響TNFR2轉(zhuǎn)位至細胞表面，而并不影響它的合成。同時，用CytD進行預處理可導致細胞表面tmTNF-α表達明顯增加。
　　 八.A

8、ctin解聚阻斷tmTNF-α誘導的TRAF2與TNFR2的解離。
　　 十.Actin的解聚逆轉(zhuǎn)了tmTNF-α誘導的NF-κB失活：采用Western方法檢測顯示，tmTNF-α使細胞胞漿中IkB-α的水平升高，提示IkB-α組成性降解受到tmTNF-α的抑制。然而，CytD預處理則阻斷tmTNF-α的抑制作用。采用ELISA方法檢測顯示，tmTNF-α顯著地抑制HL-60細胞中NF-kB組成性活化，而CyotD則封閉了tm

9、TNF-α的這一效應，并恢復了NF-kB的活性。此外，CytD單獨處理對于NF-kB的活性并無影響。
　　 十一.Actin解聚阻斷tmTNF-α誘導的Caspase-8活化及其對RIP1的剪切。
　　 十二.Actin解聚阻斷tmTNF-α抑制cFLIP的表達及其募集。
　　 下篇：tmTNF-α誘導TNFR2凋亡信號轉(zhuǎn)導的研究
　　 主要實驗結(jié)果如下：
　　 一.九株腫瘤細胞表面tmTNF-α

10、與TNFR的表達：采用FCM方法檢測結(jié)果顯示，HeLa細胞株以表達TNFR1為主，K562、Raji和HepG2細胞株則以表達TNFR2為主，而1號MCF-7、T24和239細胞株的tmTNF-α和TNFR表達率均較低且無明顯差異，3號MCF-7細胞株的tmTNF-α和TNFR表達率均較高且無明顯差異。
　　 二.Caspase抑制劑對tmTNF-a介導的細胞凋亡的影響：采用MTT方法檢測結(jié)果顯示，caspase的泛抑制劑Z-V

11、AD-FMK可使tmTNF-α對2號MCF-7、HeLa、HepG2和T24細胞株的胞毒作用受到明顯抑制；但是，該抑制劑對tmTNF-α殺傷3號MCF-7細胞株則無明顯影響。提示tmTNF-α的殺傷作用盡管需要依賴caspase，但是也可通過caspase非依賴性途徑殺傷靶細胞。
　　 三.tmTNF-a介導的細胞凋亡中Caspase-8和Caspase-3的活化
　　 結(jié)果提示tmTNF-a介導的細胞凋亡與Caspas

12、e-8和Caspase-3相關。TNFR表達類型的差異，可能影響Caspase-8活化的時間。以下我們選用表達TNFR2為主的HepG2進行實驗。
　　 四.兩型TNF-a對HepG2細胞的胞毒作用：采用MTT方法檢測結(jié)果證實，tmTNF-α可有效殺傷靶細胞，其誘導的凋亡率約40%；但是，sTNF-α對HepG2細胞無殺傷作用。用放線菌素D可部分增加HepG2細胞對sTNF-α介導的胞毒作用的敏感性。這些數(shù)據(jù)充分表明兩型TNF-

13、α對同一靶細胞可誘導不同的生物學效應。
　　 五.tmTNF-a作用12 h對HepG2細胞凋亡的影響：采用PI染色方法檢測結(jié)果證實，刺激12 h后tmTNF-α介導的細胞凋亡率約為50%，而HepG2細胞則明顯抵抗sTNF-α的殺傷效應。這些數(shù)據(jù)充分表明兩型TNF-α介導的細胞凋亡存在明顯差異。
　　 六.兩型TNF-a對HepG2細胞周期的影響：采用PI染色方法檢測結(jié)果顯示，刺激12 h后tmTNF-α組出現(xiàn)明顯的亞

14、G1峰，同時G1期的細胞約減少了40%，提示tmTNF-α主要誘導G1期細胞凋亡。而sTNF-α則導致S期細胞量增加。
　　 七.tmTNF-α通過TNFR2募集促凋亡信號分子：采用免疫共沉淀方法檢測結(jié)果顯示，刺激15 min時tmTNF-α刺激TNFR2募集FADD、RIP1和Caspase-8；刺激25 min時tmTNF-α刺激TNFR2僅募集FADD和RIP1。相反，sTNF-α則完全抑制TNFR2對上述分子的募集。同時

15、，我們未檢測出TNFR2對TRADD的募集。
　　 八.tmTNF-α抑制TNFR2募集抗凋亡信號分子：采用免疫共沉淀方法檢測結(jié)果顯示，tmTNF-α抑制了TNFR2對TRAF1、TRAF2、TRAF3、cIAP1、cIAP2、和cFLIP的募集。相反，sTNF-α則增強了TNFR2對這六個信號分子的募集。同時，sTNF-α可能通過TRAF2將NIK招募到TNFR2復合物中，而tmTNF-α則無此作用。
　　 九.tmT

16、NF-α介導NF-κB的失活與sTNF-α介導NF-κB的活化：采用ELISA方法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，tmTNF-α引起HepG2細胞組成性活化的NF-kB受到顯著性抑制，而sTNF-α則可使NF-kB進一步活化。
　　 綜上所述，兩型TNF-α啟動HepG2細胞的TNR2信號通路不同，tmTNF-α主要誘導TNFR2凋亡信號復合物（FADD/RIP1/Caspase-8）形成，而sTNF-α則主要誘導TNFR2抗凋亡信號復合物（TR

17、AF1-3/cIAP1-2/cFLIP）形成，進而分別導致靶細胞凋亡或存活。此外，Actin主要參與tmTNF-α啟動TNFR2的凋亡信號通路，即促進TNFR2募集RIP1，導致TRAF2和cFLIP與TNFR2的解離，從而促進Caspase-8活化及其對RIP1的剪切，進而導致NF-kB失活，并通過caspase級聯(lián)系統(tǒng)介導tmTNF-α的致凋亡效應。
　　 該研究不但為深入闡明兩型TNF-α的生物學特征提供實驗依據(jù)，而且為臨