tmTNF-α啟動(dòng)TNFR2凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究.pdf

1、腫瘤壞死因子-α（TNF-α），是一個(gè)多功能的細(xì)胞因子，參與各種不同的細(xì)胞活動(dòng)，其中包括誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生，細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。TNF-α首先被合成26 kDa的膜結(jié)合因子（跨膜腫瘤壞死因子-α，tmTNF-α），在金屬蛋白酶或其他酶類的作用下，從細(xì)胞膜外表面被剪切為17 kDa的可溶性分子（分泌型腫瘤壞死因子-α，sTNF-α）。兩型TNF-α以不同親和力與TNFR1和TNFR2結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)功能。
　　 細(xì)胞骨架蛋

2、白Actin已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在多種信號(hào)傳導(dǎo)通路中起著重要的調(diào)節(jié)作用，其中包括sTNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞死亡。但是，Actin是否參與tmTNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞胞毒作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)室首次發(fā)現(xiàn)tmTNF-α在殺傷靶細(xì)胞HL-60的時(shí)候，可和Actin發(fā)生免疫共沉淀。故本研究的上篇以HL-60為靶細(xì)胞，探討tmTNF-α殺傷信號(hào)和靶細(xì)胞骨架蛋白Actin之間的關(guān)系。下篇以HepG2細(xì)胞為模型，研究tmTNF-α誘導(dǎo)TNFR2凋亡信號(hào)復(fù)合物的形成，為干

3、預(yù)臨床腫瘤探尋新的分子靶點(diǎn)。
　　 上篇：骨架蛋白Actin參與tmTNF-α殺傷信號(hào)的研究
　　 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 一.CytD對(duì)Actin聚合的影響：在不同的時(shí)間點(diǎn)使用非中毒劑量的CytD（2 mM）來處理HL-60細(xì)胞，激光共聚焦圖像顯示，在對(duì)照組細(xì)胞中，Actin主要分布于細(xì)胞核周圍以及細(xì)胞膜下。但是隨著CytD作用時(shí)間的延長(zhǎng)，Actin明顯分散于細(xì)胞胞漿中，且細(xì)胞熒光強(qiáng)度高于對(duì)照組細(xì)胞。

4、　　 二.CytD預(yù)先作用靶細(xì)胞時(shí)間對(duì)tmTNF-a殺傷作用的影響：采用MTT方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，tmTNF-的細(xì)胞胞毒作用隨著CytD預(yù)處理時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。在CytD預(yù)作用120 min時(shí)，其對(duì)Actin的聚合和tmTNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞胞毒作用的抑制強(qiáng)度最大，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用2mM CytD預(yù)處理2小時(shí)。使用特異性抗體中和tmTNF-α的作用，完全抑制了這種膜分子的細(xì)胞毒效應(yīng)。
　　 三.Actin解聚抑制了tmTNF-α介導(dǎo)的

5、細(xì)胞凋亡。
　　 四.TNFR１和TNFR2抗體交叉反應(yīng)的鑒定：采用Western方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，抗TNFR1的單克隆抗體只能檢測(cè)到人sTNFR1和HL-60細(xì)胞中的TNFR1，而抗TNFR2的單克隆抗體只能檢測(cè)到人sTNFR2和HL-60細(xì)胞中的TNFR2。提示這兩種抗TNFR1和抗TNFR2的單克隆抗體不存在交叉反應(yīng)，可以用于后續(xù)的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。
　　 五.Actin解聚影響TNF-α介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，結(jié)果提示Acti

6、n參與兩型TNF-α不同的信號(hào)通路，且主要與TNFR2相關(guān)。
　　 六.tmTNF-α介導(dǎo)的TNFR2與Actin的相互作用可以被CytD阻斷：采用免疫共沉淀方法檢測(cè)證實(shí)，Actin可少量與TNFR1發(fā)生免疫共沉淀，且各處理因素對(duì)之無影響。相反，tmTNF-α可明顯增加Actin與TNFR2共沉淀的量，然而，用CytD促進(jìn)Actin解聚則完全阻斷了tmTNF-α誘導(dǎo)的Actin與TNFR2的結(jié)合。提示Actin主要通過TNFR2

7、而不是TNFR1來參與tmTNF-α介導(dǎo)的調(diào)亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
　　 七.Actin解聚對(duì)TNF及其受體表達(dá)的影響：采用FCM檢測(cè)證實(shí)，CytD的預(yù)處理導(dǎo)致該細(xì)胞TNFR2表達(dá)明顯降低，但對(duì)TNFR1的表達(dá)卻并無影響。由于Actin解聚對(duì)細(xì)胞裂解物中TNFR2的總量并無影響，提示Actin可能影響TNFR2轉(zhuǎn)位至細(xì)胞表面，而并不影響它的合成。同時(shí)，用CytD進(jìn)行預(yù)處理可導(dǎo)致細(xì)胞表面tmTNF-α表達(dá)明顯增加。
　　 八.A

8、ctin解聚阻斷tmTNF-α誘導(dǎo)的TRAF2與TNFR2的解離。
　　 十.Actin的解聚逆轉(zhuǎn)了tmTNF-α誘導(dǎo)的NF-κB失活：采用Western方法檢測(cè)顯示，tmTNF-α使細(xì)胞胞漿中IkB-α的水平升高，提示IkB-α組成性降解受到tmTNF-α的抑制。然而，CytD預(yù)處理則阻斷tmTNF-α的抑制作用。采用ELISA方法檢測(cè)顯示，tmTNF-α顯著地抑制HL-60細(xì)胞中NF-kB組成性活化，而CyotD則封閉了tm

9、TNF-α的這一效應(yīng)，并恢復(fù)了NF-kB的活性。此外，CytD單獨(dú)處理對(duì)于NF-kB的活性并無影響。
　　 十一.Actin解聚阻斷tmTNF-α誘導(dǎo)的Caspase-8活化及其對(duì)RIP1的剪切。
　　 十二.Actin解聚阻斷tmTNF-α抑制cFLIP的表達(dá)及其募集。
　　 下篇：tmTNF-α誘導(dǎo)TNFR2凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究
　　 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 一.九株腫瘤細(xì)胞表面tmTNF-α

10、與TNFR的表達(dá)：采用FCM方法檢測(cè)結(jié)果顯示，HeLa細(xì)胞株以表達(dá)TNFR1為主，K562、Raji和HepG2細(xì)胞株則以表達(dá)TNFR2為主，而1號(hào)MCF-7、T24和239細(xì)胞株的tmTNF-α和TNFR表達(dá)率均較低且無明顯差異，3號(hào)MCF-7細(xì)胞株的tmTNF-α和TNFR表達(dá)率均較高且無明顯差異。
　　 二.Caspase抑制劑對(duì)tmTNF-a介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響：采用MTT方法檢測(cè)結(jié)果顯示，caspase的泛抑制劑Z-V

11、AD-FMK可使tmTNF-α對(duì)2號(hào)MCF-7、HeLa、HepG2和T24細(xì)胞株的胞毒作用受到明顯抑制；但是，該抑制劑對(duì)tmTNF-α殺傷3號(hào)MCF-7細(xì)胞株則無明顯影響。提示tmTNF-α的殺傷作用盡管需要依賴caspase，但是也可通過caspase非依賴性途徑殺傷靶細(xì)胞。
　　 三.tmTNF-a介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中Caspase-8和Caspase-3的活化
　　 結(jié)果提示tmTNF-a介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與Caspas

12、e-8和Caspase-3相關(guān)。TNFR表達(dá)類型的差異，可能影響Caspase-8活化的時(shí)間。以下我們選用表達(dá)TNFR2為主的HepG2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　 四.兩型TNF-a對(duì)HepG2細(xì)胞的胞毒作用：采用MTT方法檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，tmTNF-α可有效殺傷靶細(xì)胞，其誘導(dǎo)的凋亡率約40%；但是，sTNF-α對(duì)HepG2細(xì)胞無殺傷作用。用放線菌素D可部分增加HepG2細(xì)胞對(duì)sTNF-α介導(dǎo)的胞毒作用的敏感性。這些數(shù)據(jù)充分表明兩型TNF-

13、α對(duì)同一靶細(xì)胞可誘導(dǎo)不同的生物學(xué)效應(yīng)。
　　 五.tmTNF-a作用12 h對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響：采用PI染色方法檢測(cè)結(jié)果證實(shí)，刺激12 h后tmTNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率約為50%，而HepG2細(xì)胞則明顯抵抗sTNF-α的殺傷效應(yīng)。這些數(shù)據(jù)充分表明兩型TNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡存在明顯差異。
　　 六.兩型TNF-a對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響：采用PI染色方法檢測(cè)結(jié)果顯示，刺激12 h后tmTNF-α組出現(xiàn)明顯的亞

14、G1峰，同時(shí)G1期的細(xì)胞約減少了40%，提示tmTNF-α主要誘導(dǎo)G1期細(xì)胞凋亡。而sTNF-α則導(dǎo)致S期細(xì)胞量增加。
　　 七.tmTNF-α通過TNFR2募集促凋亡信號(hào)分子：采用免疫共沉淀方法檢測(cè)結(jié)果顯示，刺激15 min時(shí)tmTNF-α刺激TNFR2募集FADD、RIP1和Caspase-8；刺激25 min時(shí)tmTNF-α刺激TNFR2僅募集FADD和RIP1。相反，sTNF-α則完全抑制TNFR2對(duì)上述分子的募集。同時(shí)

15、，我們未檢測(cè)出TNFR2對(duì)TRADD的募集。
　　 八.tmTNF-α抑制TNFR2募集抗凋亡信號(hào)分子：采用免疫共沉淀方法檢測(cè)結(jié)果顯示，tmTNF-α抑制了TNFR2對(duì)TRAF1、TRAF2、TRAF3、cIAP1、cIAP2、和cFLIP的募集。相反，sTNF-α則增強(qiáng)了TNFR2對(duì)這六個(gè)信號(hào)分子的募集。同時(shí)，sTNF-α可能通過TRAF2將NIK招募到TNFR2復(fù)合物中，而tmTNF-α則無此作用。
　　 九.tmT

16、NF-α介導(dǎo)NF-κB的失活與sTNF-α介導(dǎo)NF-κB的活化：采用ELISA方法檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，tmTNF-α引起HepG2細(xì)胞組成性活化的NF-kB受到顯著性抑制，而sTNF-α則可使NF-kB進(jìn)一步活化。
　　 綜上所述，兩型TNF-α啟動(dòng)HepG2細(xì)胞的TNR2信號(hào)通路不同，tmTNF-α主要誘導(dǎo)TNFR2凋亡信號(hào)復(fù)合物（FADD/RIP1/Caspase-8）形成，而sTNF-α則主要誘導(dǎo)TNFR2抗凋亡信號(hào)復(fù)合物（TR

17、AF1-3/cIAP1-2/cFLIP）形成，進(jìn)而分別導(dǎo)致靶細(xì)胞凋亡或存活。此外，Actin主要參與tmTNF-α啟動(dòng)TNFR2的凋亡信號(hào)通路，即促進(jìn)TNFR2募集RIP1，導(dǎo)致TRAF2和cFLIP與TNFR2的解離，從而促進(jìn)Caspase-8活化及其對(duì)RIP1的剪切，進(jìn)而導(dǎo)致NF-kB失活，并通過caspase級(jí)聯(lián)系統(tǒng)介導(dǎo)tmTNF-α的致凋亡效應(yīng)。
　　 該研究不但為深入闡明兩型TNF-α的生物學(xué)特征提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，而且為臨