

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權,請進行舉報或認領
文檔簡介
1、腫瘤壞死因子-α(TNF-α),是一個多功能的細胞因子,參與各種不同的細胞活動,其中包括誘導其他細胞因子的產(chǎn)生,細胞的增殖、分化和凋亡。TNF-α首先被合成26 kDa的膜結(jié)合因子(跨膜腫瘤壞死因子-α,tmTNF-α),在金屬蛋白酶或其他酶類的作用下,從細胞膜外表面被剪切為17 kDa的可溶性分子(分泌型腫瘤壞死因子-α,sTNF-α)。兩型TNF-α以不同親和力與TNFR1和TNFR2結(jié)合而發(fā)揮生物學功能。
細胞骨架蛋
2、白Actin已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在多種信號傳導通路中起著重要的調(diào)節(jié)作用,其中包括sTNF-α介導的細胞死亡。但是,Actin是否參與tmTNF-α介導的細胞胞毒作用尚不清楚。本實驗室首次發(fā)現(xiàn)tmTNF-α在殺傷靶細胞HL-60的時候,可和Actin發(fā)生免疫共沉淀。故本研究的上篇以HL-60為靶細胞,探討tmTNF-α殺傷信號和靶細胞骨架蛋白Actin之間的關系。下篇以HepG2細胞為模型,研究tmTNF-α誘導TNFR2凋亡信號復合物的形成,為干
3、預臨床腫瘤探尋新的分子靶點。
上篇:骨架蛋白Actin參與tmTNF-α殺傷信號的研究
主要實驗結(jié)果如下:
一.CytD對Actin聚合的影響:在不同的時間點使用非中毒劑量的CytD(2 mM)來處理HL-60細胞,激光共聚焦圖像顯示,在對照組細胞中,Actin主要分布于細胞核周圍以及細胞膜下。但是隨著CytD作用時間的延長,Actin明顯分散于細胞胞漿中,且細胞熒光強度高于對照組細胞。
4、 二.CytD預先作用靶細胞時間對tmTNF-a殺傷作用的影響:采用MTT方法檢測發(fā)現(xiàn),tmTNF-的細胞胞毒作用隨著CytD預處理時間的延長而降低。在CytD預作用120 min時,其對Actin的聚合和tmTNF-α介導的細胞胞毒作用的抑制強度最大,故后續(xù)實驗均采用2mM CytD預處理2小時。使用特異性抗體中和tmTNF-α的作用,完全抑制了這種膜分子的細胞毒效應。
三.Actin解聚抑制了tmTNF-α介導的
5、細胞凋亡。
四.TNFR1和TNFR2抗體交叉反應的鑒定:采用Western方法檢測發(fā)現(xiàn),抗TNFR1的單克隆抗體只能檢測到人sTNFR1和HL-60細胞中的TNFR1,而抗TNFR2的單克隆抗體只能檢測到人sTNFR2和HL-60細胞中的TNFR2。提示這兩種抗TNFR1和抗TNFR2的單克隆抗體不存在交叉反應,可以用于后續(xù)的免疫共沉淀實驗。
五.Actin解聚影響TNF-α介導的信號轉(zhuǎn)導,結(jié)果提示Acti
6、n參與兩型TNF-α不同的信號通路,且主要與TNFR2相關。
六.tmTNF-α介導的TNFR2與Actin的相互作用可以被CytD阻斷:采用免疫共沉淀方法檢測證實,Actin可少量與TNFR1發(fā)生免疫共沉淀,且各處理因素對之無影響。相反,tmTNF-α可明顯增加Actin與TNFR2共沉淀的量,然而,用CytD促進Actin解聚則完全阻斷了tmTNF-α誘導的Actin與TNFR2的結(jié)合。提示Actin主要通過TNFR2
7、而不是TNFR1來參與tmTNF-α介導的調(diào)亡信號轉(zhuǎn)導途徑。
七.Actin解聚對TNF及其受體表達的影響:采用FCM檢測證實,CytD的預處理導致該細胞TNFR2表達明顯降低,但對TNFR1的表達卻并無影響。由于Actin解聚對細胞裂解物中TNFR2的總量并無影響,提示Actin可能影響TNFR2轉(zhuǎn)位至細胞表面,而并不影響它的合成。同時,用CytD進行預處理可導致細胞表面tmTNF-α表達明顯增加。
八.A
8、ctin解聚阻斷tmTNF-α誘導的TRAF2與TNFR2的解離。
十.Actin的解聚逆轉(zhuǎn)了tmTNF-α誘導的NF-κB失活:采用Western方法檢測顯示,tmTNF-α使細胞胞漿中IkB-α的水平升高,提示IkB-α組成性降解受到tmTNF-α的抑制。然而,CytD預處理則阻斷tmTNF-α的抑制作用。采用ELISA方法檢測顯示,tmTNF-α顯著地抑制HL-60細胞中NF-kB組成性活化,而CyotD則封閉了tm
9、TNF-α的這一效應,并恢復了NF-kB的活性。此外,CytD單獨處理對于NF-kB的活性并無影響。
十一.Actin解聚阻斷tmTNF-α誘導的Caspase-8活化及其對RIP1的剪切。
十二.Actin解聚阻斷tmTNF-α抑制cFLIP的表達及其募集。
下篇:tmTNF-α誘導TNFR2凋亡信號轉(zhuǎn)導的研究
主要實驗結(jié)果如下:
一.九株腫瘤細胞表面tmTNF-α
10、與TNFR的表達:采用FCM方法檢測結(jié)果顯示,HeLa細胞株以表達TNFR1為主,K562、Raji和HepG2細胞株則以表達TNFR2為主,而1號MCF-7、T24和239細胞株的tmTNF-α和TNFR表達率均較低且無明顯差異,3號MCF-7細胞株的tmTNF-α和TNFR表達率均較高且無明顯差異。
二.Caspase抑制劑對tmTNF-a介導的細胞凋亡的影響:采用MTT方法檢測結(jié)果顯示,caspase的泛抑制劑Z-V
11、AD-FMK可使tmTNF-α對2號MCF-7、HeLa、HepG2和T24細胞株的胞毒作用受到明顯抑制;但是,該抑制劑對tmTNF-α殺傷3號MCF-7細胞株則無明顯影響。提示tmTNF-α的殺傷作用盡管需要依賴caspase,但是也可通過caspase非依賴性途徑殺傷靶細胞。
三.tmTNF-a介導的細胞凋亡中Caspase-8和Caspase-3的活化
結(jié)果提示tmTNF-a介導的細胞凋亡與Caspas
12、e-8和Caspase-3相關。TNFR表達類型的差異,可能影響Caspase-8活化的時間。以下我們選用表達TNFR2為主的HepG2進行實驗。
四.兩型TNF-a對HepG2細胞的胞毒作用:采用MTT方法檢測結(jié)果證實,tmTNF-α可有效殺傷靶細胞,其誘導的凋亡率約40%;但是,sTNF-α對HepG2細胞無殺傷作用。用放線菌素D可部分增加HepG2細胞對sTNF-α介導的胞毒作用的敏感性。這些數(shù)據(jù)充分表明兩型TNF-
13、α對同一靶細胞可誘導不同的生物學效應。
五.tmTNF-a作用12 h對HepG2細胞凋亡的影響:采用PI染色方法檢測結(jié)果證實,刺激12 h后tmTNF-α介導的細胞凋亡率約為50%,而HepG2細胞則明顯抵抗sTNF-α的殺傷效應。這些數(shù)據(jù)充分表明兩型TNF-α介導的細胞凋亡存在明顯差異。
六.兩型TNF-a對HepG2細胞周期的影響:采用PI染色方法檢測結(jié)果顯示,刺激12 h后tmTNF-α組出現(xiàn)明顯的亞
14、G1峰,同時G1期的細胞約減少了40%,提示tmTNF-α主要誘導G1期細胞凋亡。而sTNF-α則導致S期細胞量增加。
七.tmTNF-α通過TNFR2募集促凋亡信號分子:采用免疫共沉淀方法檢測結(jié)果顯示,刺激15 min時tmTNF-α刺激TNFR2募集FADD、RIP1和Caspase-8;刺激25 min時tmTNF-α刺激TNFR2僅募集FADD和RIP1。相反,sTNF-α則完全抑制TNFR2對上述分子的募集。同時
15、,我們未檢測出TNFR2對TRADD的募集。
八.tmTNF-α抑制TNFR2募集抗凋亡信號分子:采用免疫共沉淀方法檢測結(jié)果顯示,tmTNF-α抑制了TNFR2對TRAF1、TRAF2、TRAF3、cIAP1、cIAP2、和cFLIP的募集。相反,sTNF-α則增強了TNFR2對這六個信號分子的募集。同時,sTNF-α可能通過TRAF2將NIK招募到TNFR2復合物中,而tmTNF-α則無此作用。
九.tmT
16、NF-α介導NF-κB的失活與sTNF-α介導NF-κB的活化:采用ELISA方法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),tmTNF-α引起HepG2細胞組成性活化的NF-kB受到顯著性抑制,而sTNF-α則可使NF-kB進一步活化。
綜上所述,兩型TNF-α啟動HepG2細胞的TNR2信號通路不同,tmTNF-α主要誘導TNFR2凋亡信號復合物(FADD/RIP1/Caspase-8)形成,而sTNF-α則主要誘導TNFR2抗凋亡信號復合物(TR
17、AF1-3/cIAP1-2/cFLIP)形成,進而分別導致靶細胞凋亡或存活。此外,Actin主要參與tmTNF-α啟動TNFR2的凋亡信號通路,即促進TNFR2募集RIP1,導致TRAF2和cFLIP與TNFR2的解離,從而促進Caspase-8活化及其對RIP1的剪切,進而導致NF-kB失活,并通過caspase級聯(lián)系統(tǒng)介導tmTNF-α的致凋亡效應。
該研究不但為深入闡明兩型TNF-α的生物學特征提供實驗依據(jù),而且為臨
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 1.tmtnfα通過tnfr2誘導凋亡的信號途徑;2.抗體的制備及鑒定
- 細胞凋亡及其信號轉(zhuǎn)導
- STAT1參與tmTNF-α通過TNFR1非DD結(jié)構域介導細胞凋亡的研究.pdf
- 促凋亡蛋白(BclGs)的信號轉(zhuǎn)導機制研究.pdf
- 溴氰菊酯神經(jīng)細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導機制研究——ca39;2介導的神經(jīng)細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導機制研究
- 細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導途徑及調(diào)控的研究進展
- 雞持續(xù)冷應激啟動Nrf2抗氧化信號轉(zhuǎn)導路徑的研究.pdf
- Vavl蛋白調(diào)節(jié)JurkatT淋巴細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導的研究.pdf
- 肝干細胞的生長、分化、凋亡調(diào)控及其信號轉(zhuǎn)導研究.pdf
- TIP30誘導肝癌細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導途徑的研究.pdf
- MAPK信號轉(zhuǎn)導通路及凋亡蛋白在子癇前期中的研究.pdf
- 細胞信號轉(zhuǎn)導
- tmTNF-α在胰島素抵抗中的作用及其機制.pdf
- 細胞死亡信號轉(zhuǎn)導通路的研究.pdf
- 多氯聯(lián)苯醌誘導HepG2細胞凋亡的線粒體依賴信號轉(zhuǎn)導途徑研究.pdf
- DON誘導PC12細胞凋亡線粒體信號轉(zhuǎn)導機制的研究.pdf
- 鐵螯合劑誘導白血病細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導的實驗研究.pdf
- Cytc信號轉(zhuǎn)導對膽道梗阻大鼠中性粒細胞凋亡調(diào)控研究.pdf
- 細胞的信號轉(zhuǎn)導和整合
- 高溫誘導大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡及其信號轉(zhuǎn)導機制研究.pdf
評論
0/150
提交評論