TNFR1的內(nèi)化與脂筏關(guān)系的探討.pdf

1、脂筏和小窩是質(zhì)膜上富含膽固醇和鞘磷脂的微結(jié)構(gòu)域,在啟動(dòng)許多信號通路中起到很重要的作用。小窩在質(zhì)膜上形如瓶頸形凹陷,是脂筏的一個(gè)子集。
　　內(nèi)化作用可在細(xì)胞內(nèi)體表面募集信號分子并激活相應(yīng)的信號級聯(lián)反應(yīng)來啟動(dòng)信號通路。受體和配體可以通過多種途徑從細(xì)胞表面發(fā)生內(nèi)化。其中最主要的是網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)化作用,除此之外,脂筏也能介導(dǎo)內(nèi)化作用。
　　大量研究證實(shí)sTNF-α通過TNFR1既可以活化NF-κB,促進(jìn)細(xì)胞生存,又可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

2、。而后者依賴于受體內(nèi)化,在胞漿形成DISC信號復(fù)合物。本室前期工作發(fā)現(xiàn),用MCD破壞Hela細(xì)胞的脂筏,可以顯著增強(qiáng)sTNF-α的細(xì)胞毒效應(yīng)(p<0.01)。我們推測破壞脂筏可能通過促進(jìn)TNFR1內(nèi)化,抑制了生存信號NF-κB的活化,促進(jìn)DISC的形成,從而增強(qiáng)sTNF-α介導(dǎo)的殺傷效應(yīng)。本研究主要探討脂筏與TNFR1內(nèi)化的關(guān)系,其主要結(jié)果如下:
　　一、確定MCD作用的最佳濃度
　　1.結(jié)合前期試驗(yàn)和相關(guān)文獻(xiàn),測定不同時(shí)間

3、點(diǎn)及不同濃度的MCD對細(xì)胞的胞毒效應(yīng),確定在45min時(shí),7.5mM及以下濃度的MCD對細(xì)胞毒性小。
　　2.前期試驗(yàn)證明,破壞脂筏可降低細(xì)胞的粘附能力。同質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)證實(shí),5mM及以上濃度的MCD能顯著降低細(xì)胞的粘附現(xiàn)象。故以下實(shí)驗(yàn)采用MCD濃度為5mM,作用時(shí)間為45min。
　　二、破壞脂筏可增強(qiáng)sTNF-α介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷和凋亡
　　1.將野生型TNFR1和內(nèi)化缺陷的突變體TNFR1-Y236A轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,結(jié)

4、果證實(shí)用MCD破壞脂筏,sTNF-α對轉(zhuǎn)染野生型TNFR1靶細(xì)胞的胞毒效應(yīng)升高了18.7％(p<0.05),而對轉(zhuǎn)染TNFR1-Y236A細(xì)胞的胞毒效應(yīng)則無明顯影響。提示MCD有可能通過影響TNFR1內(nèi)化來影響靶細(xì)胞對sTNF-α的應(yīng)答。
　　2.用MCD破壞高表達(dá)TNFR1的Hela細(xì)胞的脂筏,不但可促進(jìn)sTNF-α介導(dǎo)的胞毒效應(yīng),且可提高sTNF-α誘導(dǎo)的caspase-8和caspase-3的活化,提示破壞脂筏可明顯促進(jìn)sT

5、NF-α介導(dǎo)的凋亡。
　　三、破壞脂筏減少表達(dá)在細(xì)胞表面的TNFR1
　　用MCD破壞Hela細(xì)胞的脂筏,用流式細(xì)胞術(shù)檢測sTNF-α刺激后,靶細(xì)胞表面TNFR1的表達(dá)率。結(jié)果顯示,脂筏的破壞使膜表面TNFR1的表達(dá)率下降了13.17%(p<0.05),而Western blot顯示MCD并不影響細(xì)胞內(nèi)TNFR1的總表達(dá)量。提示脂筏破壞可能促進(jìn)sTNF-α介導(dǎo)的TNFR1內(nèi)化。
　　四、構(gòu)建定位于脂筏內(nèi)的TNFR1突變

6、體
　　正常情況下,TNFR1部分在脂筏內(nèi),部分在脂筏外。為使所有TNFR1定位在脂筏內(nèi),我們通過重迭PCR將駐留于脂筏內(nèi)的caveolin1脂筏定位結(jié)構(gòu)域(301-378)連接到TNFR1胞內(nèi)內(nèi)化結(jié)構(gòu)域(1-729)。突變體命名為TNFR1-CAV,將其連接到N1-EGFP質(zhì)粒上,并瞬轉(zhuǎn)293T細(xì)胞,其表達(dá)效率達(dá)到62.4%時(shí),提取脂筏,通過抗TNFR1抗體和GFP抗體,均證實(shí)TNFR1-CAV-GFP融合蛋白全部定位在脂筏層中

7、。
　　五、激光共聚焦掃描顯微鏡觀察TNFR1及其幾種突變體的內(nèi)化
　　分別對293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染標(biāo)記了GFP的TNFR1,TNFR1-Y236A,TNFR1-ΔDD,TNFR1-CAV,在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)破壞脂筏可明顯促進(jìn)sTNF-α誘導(dǎo)的野生型和缺失DD的TNFR1的內(nèi)化,但缺失內(nèi)化結(jié)構(gòu)域的TNFR1則在任何刺激下不發(fā)生內(nèi)化。有意思的是sTNF-α不能誘導(dǎo)所有定位于脂筏內(nèi)的TNFR1-CAV發(fā)生內(nèi)化,但用MC