脂聯(lián)素與非酒精性脂肪肝炎的關(guān)系探討.pdf

1、非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是病理改變與酒精性肝病相似但無(wú)過(guò)量飲酒史的臨床病理綜合征,其疾病譜包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)、脂肪性肝纖維化/肝硬化,甚至并發(fā)肝癌,嚴(yán)重威脅人類健康。近年我國(guó)NAFLD的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢(shì),NASH作為單純脂肪肝向非酒精性肝纖維化發(fā)展的必經(jīng)階段,其發(fā)病機(jī)制尚未

2、完全清楚,因此亦缺乏有效的防治策略。脂聯(lián)素由脂肪細(xì)胞分泌,是目前發(fā)現(xiàn)的唯一與血脂水平呈負(fù)相關(guān)的膠原樣細(xì)胞因子,具有調(diào)節(jié)脂代謝、調(diào)節(jié)糖代謝、抗炎等作用。脂聯(lián)素有兩種受體:AdipoR1和AdipoR2,其中AdipoR2在肝臟中表達(dá)豐富,提示脂聯(lián)素可能參與NASH發(fā)生發(fā)展過(guò)程。噻唑烷二酮類藥物(羅格列酮)為特異性PPARγ激動(dòng)劑,我們的前期研究發(fā)現(xiàn)其具有改善蛋氨酸-膽堿缺乏(methionine-choline deficient die

3、t,MCD)飲食誘導(dǎo)的小鼠肝脂肪變、炎癥及肝纖維化,但脂聯(lián)素在此模型中的變化及其在NASH進(jìn)展中的作用及機(jī)制尚不清楚。本研究采用MCD飲食建立小鼠NASH模型,以羅格列酮進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn),探討脂聯(lián)素在NASH發(fā)病及進(jìn)展中的作用及作用機(jī)制,為NAFLD的靶向性藥物/基因治療提供新的途徑。
　　 目的:采用蛋氨酸-膽堿缺乏(MCD)飲食建立小鼠NASH模型,應(yīng)用羅格列酮進(jìn)行干預(yù)治療,觀察脂聯(lián)素、TNF-α、IL-6的表達(dá)變化與疾病進(jìn)展的

4、關(guān)系,以明確脂聯(lián)素在NASH發(fā)病中的作用及作用機(jī)制,以及PPARγ激動(dòng)劑調(diào)節(jié)脂聯(lián)素表達(dá)、阻滯NASH進(jìn)展的作用,為臨床選擇靶向性治療非酒精性脂肪性肝炎的藥物或基因治療提供理論依據(jù)。
　　 方法:選用8周齡健康雄性C57BL6/J小鼠30只,隨機(jī)分為3組,每組10只。模型組采用MCD飼料,對(duì)照組給予膽堿、蛋氨酸充足的飼料,羅格列酮干預(yù)組應(yīng)用MCD飼料加羅格列酮(50mg/kg/d),共喂養(yǎng)3周。血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine

5、 aminotransferase,ALT),甘油三酯(triglyceride,TG)采用日本Olympus AU2700全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定;采用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色及Masson染色觀察肝組織病理學(xué)改變;紅(hematoxylin-eosin,HE)染色及Masson染色觀察肝組織病理學(xué)改變;肝組織脂聯(lián)素表達(dá)采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè);TNF-α、IL-6 mRNA和蛋白表達(dá)分別采用RT-

6、PCR和Western blot檢測(cè)。
　　 結(jié)果:
　　 1動(dòng)物一般情況:對(duì)照組小鼠活潑、毛發(fā)有光澤,體重逐漸增加。模型組和羅格列酮干預(yù)組小鼠體重均下降,尤以模型組明顯。對(duì)照組、模型組和干預(yù)組小鼠體重、肝濕重分別為:26.00±1.00 g、14.14±0.68 g、14.31±0.81 g,0.89±0.12 g、0.53±0.10 g、0.56±0.10 g。模型組、羅格列酮干預(yù)組小鼠體重、肝濕重較對(duì)照組明顯下降(

7、P值均＜0.05),而羅格列酮干預(yù)組與模型組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。對(duì)照組、模型組和干預(yù)組小鼠肝臟指數(shù)分別為:0.034±0.005、0.038±0.006、0.039±0.008,各組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 2血清生化學(xué)改變:對(duì)照組、模型組和干預(yù)組小鼠血清ALT、TG水平依次為:50.78±10.03 U/L、161.56±28.23 U/L、83.56±12.27 U/L;0.54±0.29mmo

8、l/L、0.97±0.81 mmol/L、0.76±0.13 mmol/L。模型組小鼠血清ALT、TG均顯著高于對(duì)照組(P＜0.01),而羅格列酮干預(yù)后可明顯降低ALT、TG水平(P＜0.01)。
　　 3肝組織病理學(xué)變化:肉眼觀察:對(duì)照組小鼠肝臟為紅褐色,明亮有光澤。模型組小鼠肝臟體積明顯減小,整個(gè)肝臟呈淺黃色,與周圍組織有粘連,切面油膩、無(wú)光澤。羅格列酮干預(yù)組小鼠肝臟體積亦有縮小,為紅褐色、有光澤。光鏡觀察:對(duì)照組小鼠肝臟肝

9、小葉結(jié)構(gòu)正常,肝板排列整齊;模型組肝細(xì)胞彌漫性水樣變,呈現(xiàn)大泡性為主的肝細(xì)胞脂肪變,以腺泡3帶明顯,小葉內(nèi)可見(jiàn)點(diǎn)狀或灶狀肝細(xì)胞壞死伴以單個(gè)核細(xì)胞為主的混合性炎細(xì)胞浸潤(rùn),可見(jiàn)少量分葉核白細(xì)胞。匯管區(qū)及竇周纖維組織增生不明顯(F2～3G2～3S0～1)。羅格列酮干預(yù)組小鼠肝損傷較模型組明顯減輕,脂肪變肝細(xì)胞明顯減少,炎癥、壞死及纖維化程度明顯減輕(F1G1～2S0～1)。
　　 4肝組織TNF-αmRNA的表達(dá):與對(duì)照組相比,模型組

10、TNF-αmRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)(0.82±0.17 vs.1.26±0.33,P＜0.05),而羅格列酮干預(yù)組表達(dá)較模型組減弱(1.26±0.33 vs.0.94±0.14,P＜0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5肝組織TNF-α蛋白水平表達(dá)情況:與對(duì)照組相比,模型組TNF-α蛋達(dá)較模型組明顯減少(1.21±0.05 vs.0.83±0.03,P＜0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 6肝組織IL-6 mRNA表

11、達(dá)情況:與對(duì)照組相比,模型組IL-6 mRNA表達(dá)顯著增加(0.34±0.01 vs.0.89±0.01,P＜0.01),而羅格列酮干預(yù)組表達(dá)較模型組明顯下降(0.89±0.01 vs.0.57±0.03,P＜0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 7小鼠肝組織IL-6蛋白表達(dá)情況:與對(duì)照組相比,模型組IL-6蛋白表達(dá)顯著增加(0.46±0.01 vs.0.91±0.01,P＜0.01),而羅格列酮干預(yù)組表達(dá)較模型組明顯下降(0

12、.91±0.01 vs.0.79±0.02,P＜0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 8肝組織脂聯(lián)素的表達(dá)變化:對(duì)照組小鼠肝組織脂聯(lián)素在小葉中央靜脈周圍及竇內(nèi)皮細(xì)胞有少量表達(dá);與對(duì)照組相比,模型組肝臟脂聯(lián)素表達(dá)明顯增強(qiáng),且多表達(dá)于脂肪變肝細(xì)胞胞漿、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)區(qū)枯否細(xì)胞胞漿及竇內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中,(1.46±0.27 vs.15.24±0.36,P＜0.01);羅格列酮干預(yù)組脂聯(lián)素陽(yáng)性表達(dá)較模型組明顯減少(15.24±0.36 v

13、s.9.46±0.74,P＜0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝組織中脂聯(lián)素表達(dá)明顯上調(diào),并與TNF-α及IL-6表達(dá)呈一致趨勢(shì),提示在NASH小鼠肝脂肪變及炎癥的發(fā)生及進(jìn)展中,脂聯(lián)素可能通過(guò)代償性表達(dá)增加來(lái)拮抗炎性因子的表達(dá),從而阻止疾病的進(jìn)展。
　　 2羅格列酮可上調(diào)PPARγ基因的表達(dá),進(jìn)一步上調(diào)脂聯(lián)素表達(dá)水平、抑制炎癥因子TNF-α、IL-6的表達(dá),從而延緩或阻