重組脂聯(lián)素在非酒精性脂肪肝病中作用的初步探討.pdf

1、目的：研究重組AdipoQ基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)情況，利用電穿孔的方法將表達(dá)載體導(dǎo)入減毒沙門氏菌并表達(dá)，純化蛋白，檢測(cè)其在體外對(duì)L-02肝細(xì)胞脂肪變性的抑制作用，為人AdipoQ在NAFLD的基因治療方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法：（1）從人脂肪組織中提取總RNA，通過RT-PCR方法獲得AdipoQ基因，將其克隆到真核熒光表達(dá)載體pEGFP-N1上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-N1-AdipoQ；（2）將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，通

2、過報(bào)告基因熒光蛋白的表達(dá)、RT-PCR和Western blot檢測(cè)其融合蛋白在真核細(xì)胞中的表達(dá)；（3）將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-AdipoQ通過電穿孔的方法導(dǎo)入減毒沙門氏菌并表達(dá)；（4）通過亞克隆法構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a（+）-AdipoQ，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)pET32a（+）-AdipoQ融合蛋白。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA瓊脂糖樹脂純化后，用Western Blot分析；（5）將融合蛋白作用于油酸誘導(dǎo)脂肪變的

3、L-02肝細(xì)胞，研究其對(duì)肝細(xì)胞脂肪變的抑制情況。 結(jié)果：（1）通過RT-PCR方法克隆得到AdipoQ基因片斷，長(zhǎng)度為744bp，與目的基因片段大小相一致；（2）重組質(zhì)粒pEGFP-N1-AdipoQ構(gòu)建成功，AdipoQ在真核細(xì)胞中表達(dá)，并與熒光蛋白融合； （3）攜帶AdipoQ基因真核表達(dá)載體的減毒沙門氏菌株構(gòu)建成功；（4）純化pET32a（+）-AdipoQ融合蛋白；（5）AdipoQ對(duì)油酸誘導(dǎo)脂肪變的L-02肝細(xì)