清脂護肝方對Src家族相關激酶Hck在非酒精性脂肪性肝病中的作用機制探討.pdf

1、非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種以無過量飲酒史和其他明確肝損害因素引起的肝實質細胞的脂肪變性、壞死以及炎性細胞的浸潤和脂肪積貯等為特征的臨床病理綜合癥。非酒精性脂肪肝炎(Non-alcohlic Steatohepatitis，NASH)是指肝細胞脂肪變性、小葉和/或匯管區(qū)炎癥，有時伴有肝纖維化和Mallory小體形成的一種病理狀態(tài)，在NAFLD中占30％～50％，

2、這是造成非酒精性脂肪性肝硬化、肝癌等并發(fā)癥的重要環(huán)節(jié)，阻斷這一環(huán)節(jié)就能夠改變NAFLD的預后，因此探討清脂護肝方在NASH中的作用及其機制可為臨床治療NAFLD提供一定的理論依據(jù)。
　　通過觀察清脂護肝方對NASH大鼠肝功能、血脂、炎癥因子(IL-1、IL-6、TNF-α)以及NASH大鼠肝組織和kupffer細胞中Src家族相關激酶Hck表達的影響，探討清脂護肝方在NASH中的作用及其機制。
　　人體水平研究:選取2012

3、-2014年南通市第三人民醫(yī)院病理科經(jīng)診斷為NAFLD的肝組織蠟塊12例，以及正常肝組織10例，用免疫組織化學(Immunohistochemistry，IHC)方法檢測Src家族相關激酶Hck的表達水平。細胞實驗:qRT-PCR:培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的kupffer細胞，采用Trizol一步法提取RNA并反轉錄成cDNA，用q RT-PCR方法檢測Src家族相關激酶Hck的mRNA的表達情況;培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的kupffer細胞，用60％

4、濃度CCL4損傷液刺激4h[2]后用20％清脂護肝方藥物血清（前期實驗研究表明:清脂護肝方藥物血清添加量為20％時，增值實驗數(shù)據(jù)最高，效果最好），并反轉錄成cDNA，采用qRT-PCR方法檢測藥物干預前后Src家族相關激酶Hck mRNA的表達情況;免疫細胞化學(Immunocytochemistry，ICC):對生長狀態(tài)良好的kupffer細胞，用60％濃度CCL4損傷液刺激4h后分別用20％清脂護肝方藥物血清繼續(xù)培養(yǎng)48h，用ICC

5、的方法檢測Src家族相關激酶Hck的表達水平;蛋白質免疫印跡法(Western Blot):收集生長狀態(tài)良好的kupffer細胞，提取蛋白，采用Western Blot的方法檢測Src家族相關激酶Hck的mRNA的表達情況。動物實驗:選用2月齡雄性SD大鼠喂養(yǎng)高脂飼料制備成NASH模型，將造模成功的大鼠再隨機分為模型組、低劑量清脂護肝方組、中劑量清脂護肝方組和高劑量清脂護肝方組，模型組予0.9％NaCl溶液灌胃;清脂護肝方組分別以2.4

6、3g/kg/d，12.15g/kg/d，24.3g/kg/d灌胃6周;對照組注射等體積生理鹽水。觀察記錄大鼠的行為表現(xiàn)及體質量變化。實驗結束后，處死實驗大鼠，采用OLYMPUS全自動生化分析儀及配套試劑檢測肝功能及血脂;并對肝組織病理切片采用蘇木精-伊紅染色觀察大鼠脂肪變性及炎癥程度;IHC法檢測NASH大鼠肝組織中Src家族相關激酶Hck的表達水平;ELISA法檢測血清中NASH炎癥因子（IL-1、IL-6、TNF-α）的表達情況。<

7、br>　　人體水平研究:IHC結果表明:Hck在人體正常肝組織中低表達，炎癥組織中表達增高，二者比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);細胞實驗:q RT-PCR:Hck的mRNA在Kuffer細胞中的表達豐度滿足敲減實驗要求，用60％CCL4損傷液刺激后Hck的mRNA表達明顯升高(P＜0.05);用清脂護肝方藥物血清干預后:Hck的mRNA表達降低，且呈劑量依賴性。ICC:Hck在kupffer細胞中有表達，呈棕黃色顆粒，并與炎癥程度呈正

8、相關，藥物血清培養(yǎng)后表達減少，棕黃色顆粒明顯變錢、變少，呈散在分布;Western Blot:Hck在鼠kupffer細胞中表達明顯。動物實驗:IHC結果表明:Hck在正常肝臟組織kupffer細胞低表達，炎癥刺激時高表達，且與炎癥反應呈極高正相關;用清脂護肝方對NASH大鼠進行干預治療后，我們發(fā)現(xiàn)用藥組無論是低、中、高劑量組，在抑制Src相關激酶成員Hck的陽性表達時有顯著效果，特別是高劑量組，與模型組比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)

9、; ELISA:與正常組比較，模型組NASH炎癥因子IL-1、IL-6表達有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，TNF-α表達有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與模型組比較，中、高劑量組IL-1、IL-6表達有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，尤以高劑量組明顯，TNF-α表達無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　Hck在正常肝臟組織kupffer細胞中低表達，炎癥刺激時高表達，且與炎癥反應呈極高正相關;用清脂護肝方對NASH大鼠進行干預治療后