清脂護肝方及Src抑制劑PP2在非酒精性脂肪性肝病中的作用機制探討.pdf

1、背景:非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種以無過量飲酒史和其他明確肝損害因素引起的肝實質(zhì)細(xì)胞的脂肪變性、壞死以及炎性細(xì)胞的浸潤和脂肪積貯等為特征的臨床病理綜合癥[1]。非酒精性脂肪肝炎(Non-alcohlic Steatohepatitis，NASH)是指肝細(xì)胞脂肪變性、小葉和/或匯管區(qū)炎癥，有時伴有肝纖維化和Mallory小體形成的一種病理狀態(tài)，在NAFLD中占30

2、％～50％，這是造成非酒精性脂肪性肝硬化、肝癌等并發(fā)癥的重要環(huán)節(jié)，阻斷這一環(huán)節(jié)就能夠改變NAFLD的預(yù)后，因此探討清脂護肝方及Src抑制劑PP2在NASH中的作用及其機制可為臨床治療NAFLD提供一定的理論依據(jù)。
　　目的:通過觀察清脂護肝方及Src抑制劑PP2對NASH大鼠肝功能、血脂、炎癥因子(IL-1、IL-6、TNF-α)以及NASH大鼠肝組織和kupffer細(xì)胞中Src家族相關(guān)激酶(Hck、Lyn、Fgr)和Src抑制的

3、蛋白激酶C底物（Src-suppressed C kinase substrate，SSeCKS）表達(dá)的影響，探討清脂護肝方及Src抑制劑PP2在NASH中的作用及其機制。
　　方法:人體水平研究:選取2012-2014年南通市第三人民醫(yī)院病理科經(jīng)診斷為NAFLD的肝組織蠟塊12例，以及正常肝組織10例，用免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，IHC）方法檢測Src家族相關(guān)激酶(Hck、Lyn、Fgr)和SSeC

4、KS分子的表達(dá)水平。細(xì)胞實驗:qRT-PCR:培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的kupffer細(xì)胞，采用Trizol一步法提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用q RT-PCR方法檢測Src家族相關(guān)激酶(Hck、Lyn、Fgr)和SSeCKS分子mRNA的表達(dá)情況;培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的kupffer細(xì)胞，用60％濃度CCL4損傷液刺激4h[2]后用20％清脂護肝方藥物血清（前期實驗研究表明:清脂護肝方藥物血清添加量為20％時，增值實驗數(shù)據(jù)最高，效果最好）及Sr

5、c抑制劑PP2（濃度為5、10、20、40ug/ml）繼續(xù)培養(yǎng)48h后提取RNA[3]，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用q RT-PCR方法檢測藥物干預(yù)前后Src家族相關(guān)激酶(Hck、Ly、Fgr)和SSeCKS分子mRNA的表達(dá)情況;免疫細(xì)胞化學(xué)(Immunocytochemistry，ICC):對生長狀態(tài)良好的kupffer細(xì)胞，用60％濃度CCL4損傷液刺激4h后分別用20％清脂護肝方藥物血清繼續(xù)培養(yǎng)48h和Src抑制劑PP2刺激30rm

6、in，用ICC的方法檢測Src家族相關(guān)激酶(Hck、Lyn、Fgr)和SSeCKS分子的表達(dá)水平;蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot):收集生長狀態(tài)良好的kupffer細(xì)胞，提取蛋白，采用WesteBlot的方法檢測Src家族相關(guān)激酶(Hck、Lyn、Fgr)和SSeCKS分子mRNA的表達(dá)情況。動物實驗:選用2月齡雄性SD大鼠喂養(yǎng)高脂飼料制備成NASH模型，將造模成功的大鼠再隨機分為模型組、PP2組、低劑量清脂護肝方組、中劑量

7、清脂護肝方組和高劑量清脂護肝方組，模型組予0.9％NaCl溶液灌胃;清脂護肝方組分別以2.43g/kg/d，12.15g/kg/d，24.3g/kg/d灌胃6周;PP2組于造模后第1天至第5天腹腔注射10mmol/LSrc抑制劑PP20.1ml，[4]對照組注射等體積生理鹽水。觀察記錄大鼠的行為表現(xiàn)及體質(zhì)量變化。實驗結(jié)束后，處死實驗大鼠，采用OLYMPUS全自動生化分析儀及配套試劑檢測肝功能及血脂;并對肝組織病理切片采用蘇木精-伊紅染色

8、觀察大鼠脂肪變性及炎癥程度;IHC法檢測NASH大鼠肝組織中Src家族相關(guān)激酶(Hck、Ly、Fgr)和SSeCKS分子的表達(dá)水平;ELISA法檢測血清中NASH炎癥因子(IL-1、IL-6、TNF-α)的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:人體水平研究:IHC結(jié)果表明:Hck、Lyn在人體正常肝組織中低表達(dá)，炎癥組織中表達(dá)增高，二者比較有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;而在正常肝組織或肝臟炎癥組織中Fgr、SSeCKS均未見明顯表達(dá)。細(xì)胞實驗:q

9、RT-PCR: Hck、Lyn mRNA在Kuffer細(xì)胞中的表達(dá)豐度滿足敲減實驗要求，SSeCKS mRNA在Kuffer細(xì)胞中表達(dá)豐度較低，不滿足敲減實驗要求，而Fgr mRNA在Kuffer細(xì)胞中沒有表達(dá);用60％CCL4損傷液刺激后Hck、Lyn mRNA表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，SSeCKS mRNA表達(dá)減少，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);用清脂護肝方藥物血清及Src抑制劑PP2干預(yù)后:Hck、Lyn mRNA表達(dá)降低，

10、且呈劑量依賴性;SSeCKS mRNA表達(dá)稍有升高，而Fgr mRNA未見表達(dá)。ICC: Hck在kupffer細(xì)胞中有表達(dá)，呈棕黃色顆粒，并與炎癥程度呈正相關(guān)，藥物血清及Src抑制劑PP2培養(yǎng)后表達(dá)減少，棕黃色顆粒明顯變錢、變少，呈散在分布;而Lyn、Fgr和SSeCKS在kupffer細(xì)胞中無明顯表達(dá);Western Blot:Hck、Lyn、SSeCKS在鼠kupffer細(xì)胞中均有表達(dá)，尤以Hck、SSeCKS表達(dá)明顯，而Fgr在

11、鼠kupffer細(xì)胞中未見明顯表達(dá)。動物實驗:IHC結(jié)果表明:Lyn、Hck在正常肝臟組織kupffer細(xì)胞低表達(dá)，炎癥刺激時高表達(dá)，且與炎癥反應(yīng)呈極高正相關(guān);SSeCKS則在正常肝臟組織kupffer細(xì)胞低表達(dá)，炎癥刺激時表達(dá)減少，與炎癥反應(yīng)程度呈負(fù)相關(guān);Fgr在正常肝臟組織kupffer細(xì)胞極低表達(dá)，炎癥刺激后幾乎不表達(dá);用清脂護肝方及Src抑制劑PP2對NASH大鼠進行干預(yù)治療后，我們發(fā)現(xiàn)用藥組無論是低、中、高劑量組或是PP2組，

12、在抑制Hck、Lyn兩種Src相關(guān)激酶成員的陽性表達(dá)時有顯著效果，特別是高劑量組，與模型組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);模型組SSeCKS蛋白的表達(dá)顯著低于正常組，在治療組中的表達(dá)介于模型組和正常組，同時伴隨Lyn、Hck表達(dá)的升高呈減少趨勢;且清脂護肝方對Fgr的表達(dá)無明顯影響，用藥前后無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05); ELISA:與正常組比較，模型組NASH炎癥因子IL-1、IL-6表達(dá)有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，TNF-α

13、表達(dá)有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);與模型組比較，中、高劑量組IL-1、IL-6表達(dá)有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，尤以高劑量組明顯，TNF-α表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:當(dāng)炎癥刺激時，SSeCKS與Lyn、Hck的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，Lyn與Hck的表達(dá)呈正相關(guān);我們推斷SSeCKS與Src家族相關(guān)激酶（Lyn、Hck）存在某種上下游抑制關(guān)系;Fgr與Lyn、Hck家族成員本身可能存在某種競爭抑制作用;提示Src家族