護肝清脂片治療非酒精性脂肪肝病的藥效學(xué)研究及機制探討.pdf

1、研究背景:
　　 護肝清脂片為原第一軍醫(yī)大學(xué)名老中醫(yī)臧壟堂教授的經(jīng)驗方，由澤瀉、山楂、三七、蒲黃、荷葉以及陳皮六味中藥組成，經(jīng)多年的臨床驗證，其具有良好的改善患者高血脂、胰島素抵抗作用，可作為治療非酒精性脂肪肝NAFLD(non-alcoholic fatty liver disease)疾病的良方。NAFLD的發(fā)病機制網(wǎng)絡(luò)信號非常復(fù)雜，而沉默信息因子SIRT1經(jīng)研究報道在NAFLD中起著極其重要的作用。沉默信息因子SIRT1屬

2、于Sirtuin家族，最初定義為NAD+依賴的去乙酰化酶家族，可使多種蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基發(fā)生去乙?；?，Sirtuin是一類進化上高度保守的蛋白質(zhì)，參與了細胞內(nèi)多種生物學(xué)事件的發(fā)生，尤其是在細胞生存、壽命和物質(zhì)代謝中具有重要作用。大量證據(jù)顯示，NAFLD患者常常伴隨著肥胖、脂代謝紊亂和胰島素抵抗等代謝紊亂特征，美國臨床內(nèi)分泌一時學(xué)會提出的代謝綜合征(MS)中已經(jīng)將NAFLD作為MS的主要條件，而SIRT1在體內(nèi)的表達和活性受NAD+/NA

3、DH比率的調(diào)節(jié)，而體內(nèi)的NAD+/NADH比率反映了機體或細胞的物質(zhì)能量代謝狀態(tài)。在某種程度上，SIRT1可能起著一種營養(yǎng)感受器樣的作用，通過細胞內(nèi)NAD+水平波動來感知細胞內(nèi)物質(zhì)能量代謝狀態(tài)，其可能在調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝、體內(nèi)能量和營養(yǎng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用，而肝臟是機體調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝、能量和營養(yǎng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、調(diào)控血糖的重要器官，NAFLD是在肝臟發(fā)生的最為常見的疾病，NAFLD的發(fā)生是否也與能感知細胞能量狀態(tài)的SIRT1相關(guān)，是一個十分值得

4、關(guān)注的問題，護肝清脂片在改善NAFLD疾病的同時是否也促進了機體內(nèi)肝臟組織中SIRT1的表達，這對探討護肝清片防治NAFLD的作用機理具有重要的意義。
　　 NAFLD是指除酒精外和其他明確的損肝因素所致的，以彌漫性肝細胞大泡性脂肪病變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征，包括單純性脂肪肝以及由其演變的脂肪性肝炎和肝硬化。流行病學(xué)研究顯示NAFLD可以影響任何年齡和任何種族的人群，在不同的國家當(dāng)中大致有14％～24％的人患有NANLD，肥

5、胖人群中高達57.5％～74％，現(xiàn)今NAFLD已成為僅次于乙肝的影響人類健康的第二類慢性肝臟疾病。NAFLD發(fā)病與胰島素抵抗和遺傳易感性有關(guān)。營養(yǎng)過剩所致體重增長過快和體重過重，肥胖、糖尿病、高脂血癥等代謝綜合征相關(guān)脂肪肝，以及隱源性脂肪肝均屬于NAFLD發(fā)病原因。而SIRT1作為體內(nèi)重要的去乙?；?，在調(diào)節(jié)機體物質(zhì)代謝、體內(nèi)能量和營養(yǎng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮重要作用。陳璐璐指出能量限制(CR，calorie restriction)可以促進

6、高脂飲食建立的NAFLD大鼠模型體內(nèi)的SIRT1的表達，具有改善NAFLD的作用。而白藜蘆醇作為SIRT1的激動劑，具有改善NAFLD大鼠的胰島素抵抗、調(diào)節(jié)肝脂等作用。種種跡象都表明SIRT1在NAFLD的發(fā)病機制中起著重要的作用。護肝清脂片由澤瀉、山楂、三七、蒲黃、荷葉及陳皮六味中藥組成。經(jīng)多年臨床實踐表明:護肝清脂片在改善NAFLD患者血生化指標(biāo)、恢復(fù)正常體重以及脂肪肝等方面具有確切的療效，深受患者歡迎。但護肝清脂片防治NAFLD的

7、藥效及可能的作用機制如何我們知之甚少，限制了其推廣應(yīng)用，因此，系統(tǒng)研究其對NAFLD模型大鼠的藥效作用并深入闡明其分子作用機理，明確其作用靶點，具有重要的現(xiàn)實意義和科學(xué)意義。
　　 目的:
　　 本實驗采用高脂飲食建立大鼠NAFLD模型，旨在研究護肝清脂片對于NAFLD的具體藥效作用，同時對其作用機理進行初步探討，以期為進一步開展護肝清脂片治療NAFLD的基礎(chǔ)研究以及臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。
　　 方法:
　

8、　 將60只體重180～220g♂SD大鼠按體重隨機分為空白組(1ml/kg蒸餾水)、模型組(1ml/kg蒸餾水)、非諾貝特組(0.1g/kg)、護肝清脂片高（2.16g/kg）、中(1.08g/kg)、低劑量組(0.54g/kg)，每組10只。空白組給予普通飼料，其它各組采用高脂飼料造模，同時給予各組大鼠相應(yīng)的藥物，連續(xù)12周。12周實驗結(jié)束后，對所有大鼠進行腹主動脈采血并處死，測定肝臟相關(guān)的生化指標(biāo)、血脂、肝指數(shù)、血糖、肝臟抗氧化

9、能力、胰島素抵抗指標(biāo)等，取各組大鼠肝組織置于10％福爾馬林中固定，常規(guī)石蠟連續(xù)切片及冰凍切片，HE染色以及油紅O染色，用于觀察各組大鼠肝臟的組織形態(tài)學(xué)病變情況。同時，采用RT-PCR及west-blotting方法檢測沉默信息調(diào)節(jié)因子（SIRT1）在各組大鼠肝臟體內(nèi)的表達情況。
　　 結(jié)果:
　　 高脂飼料喂養(yǎng)12周后成功復(fù)制大鼠NAFLD模型，與空白組比較，模型組在肝臟保護作用、肝脂代謝、氧化應(yīng)激/月旨質(zhì)過氧化損傷、胰

10、島素抵抗等方面都具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。而護肝清脂片的中、高劑量組對于NAFLD模型大鼠具有一定的防治作用，能延緩NAFLD疾病的發(fā)生。護肝清脂片能抑制轉(zhuǎn)氨酶升高以及肝臟腫大，對于高脂飲食造成的肝臟損傷有一定的保護作用;生化學(xué)指標(biāo)顯示，護肝清脂片能明顯抑制病變大鼠血脂代謝紊亂以及防止肝臟脂質(zhì)蓄積，抑制空腹血糖及空腹胰島素水平的升高，增加胰島素敏感指數(shù)，降低胰島素抵抗指數(shù)，延緩胰島素抵抗;護肝清脂片能降低血液中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的含量，提

11、高血液中抗氧化酶SOD活力，對于氧化應(yīng)激/脂質(zhì)過氧化損傷也具有一定的保護作用;形態(tài)學(xué)指標(biāo)顯示，護肝清脂片能減輕NAFLD模型大鼠肝臟脂肪性病變、炎癥壞死;RT-PCR和West blotting實驗結(jié)果表明:與空白組相比，模型組SIRT1mRNA及蛋白表達顯著性降低(P＜0.05)，而護肝清脂片中、高劑量組能顯著上調(diào)肝臟中SIRT1mRNA和蛋白的表達(p＜0.05，p＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 護肝清脂片能夠顯