消脂益肝方防治高脂飲食誘導的大鼠非酒精性脂肪性肝病的機制研究.pdf

1、目的：本研究基于現(xiàn)代醫(yī)學“腸-肝軸”學說和中醫(yī)“肝脾相關”理論，在前期臨床研究和實驗研究的基礎上，探討具有健脾化濁功效的消脂益肝方對高脂飲食誘導的模型大鼠非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的防治作用，從該方對“代謝性炎癥”與腸道粘膜微生態(tài)屏障的影響角度探討其從脾論治NAFLD的作用機制。
　　方法：1.理論部分：回顧了近年來腸道微生態(tài)環(huán)境紊亂與NAFLD的相關研究進展

2、，深入分析了中醫(yī)脾和腸道微生態(tài)之間的相關性，并結合導師從脾論治慢性肝病的學術思想，從病因病機角度總結、提出了“從脾論治”防治 NAFLD的思路。2.實驗部分：無特定病原體級(Specific pathogen free，SPF)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠40只，隨機分為4組，其中空白對照組、中藥干預組（消脂益肝方組）、益生菌干預組每組各8只，模型對照組16只?？瞻讓φ战M以標準飼料飼養(yǎng)，其余3組大鼠均采用高脂飼料飼養(yǎng)，模

3、型對照組每4周隨機選取2只大鼠處死以動態(tài)評估模型的復制情況，實驗歷時16周復制出NAFLD模型。于造模第5周，中藥組以消脂益肝方12.5g·kg-1d-1的劑量灌胃給藥，益生菌組給予雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片（商品名：金雙歧）0.7g·kg-1d-1的劑量灌胃給藥，空白對照組和模型對照組予以等體積的0.9％氯化鈉溶液灌胃，每周測量1次體重，根據體重變化調整灌胃劑量，共給藥干預12周。于末次給藥24h后處死全部大鼠，采集血液和肝臟、回腸組織

4、及粘液、收集結腸內糞便樣本。
　　采用生化分析法檢測血清中丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)?天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST)的水平和肝臟組織勻漿中甘油三脂(triglyceride， TG)、游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)的含量。采用蘇木精伊紅染色法(hematoxylin eosin staining,HE)判定

5、肝組織 NAFLD活動度積分(NAFLD activity score,NAS);采用油紅O染色觀察肝臟脂質沉積情況；采用Masson染色觀察大鼠肝臟肝纖維化的情況。分別通過光學顯微鏡和電子顯微鏡對各組大鼠回腸粘膜組織進行普通病理學和超微病理學觀察。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測大鼠血清中 TNF-α(Tumor necrosis factor-α)、IL-1β

6、(Inteleukin-1β)水平。采用鱟試劑顯色基質法測定大鼠門靜脈血漿脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）的含量。采用 Western blot(免疫印跡試驗)法檢測大鼠回腸組織中 TLR4、NF-κBp65蛋白的表達。采用Real-TimePCR(SYBR Green)絕對定量法檢測分析結腸糞便中4種目標菌群的含量。免疫組織化學染色法檢測大鼠回腸組織中Occludin、ZO-1蛋白的表達。采用ELISA法測定腸道

7、粘液中SIgA的含量。
　　結果:
　　1．各組動物體重和肝指數的比較。試驗第16周，與空白對照組比較，模型對照組大鼠體重和肝指數顯著升高。而經消脂益肝方干預后，大鼠體重和肝指數均顯著下降。
　　2．各組大鼠血清、肝臟勻漿生化指標的比較。與空白對照組比較，模型對照組大鼠血清AST? ALT的水平顯著升高，而以AST升高更為顯著；肝臟勻漿組織中 TG、FFA的含量亦升高。而經消脂益肝方和益生菌干預后，大鼠血清中AST?

8、ALT和肝臟勻漿中TG、FFA的水平均顯著下降。
　　3．各組大鼠肝臟病理形態(tài)學改變。與空白對照組比較，模型對照組大鼠肝臟NAS積分顯著升高，而經消脂益肝方干預后，NAS積分顯著下降。油紅 O染色顯示模型對照組肝組織中紅色脂滴顯著增多，融合成片狀；消脂益肝方干預組大鼠肝細胞脂滴數量明顯減少，較稀疏。肝組織Masson染色顯示模型對照組膠原纖維染色明顯增多，部分標本有纖維間隔形成；而消脂益肝方干預組膠原纖維組織著色明顯減少。

9、　　4．消脂益肝方對NAFLD模型大鼠代謝性炎癥指標的影響。與空白對照組比較，模型對照組大鼠門靜脈血漿LPS含量和血清IL-1β、TNF-α水平顯著升高；而消脂益肝方干預可明顯降低血漿 LPS含量和血清 IL-1β、TNF-α的水平顯著下降。
　　5．消脂益肝方對NAFLD模型大鼠腸粘膜微生態(tài)屏障的影響。試驗主要從腸粘膜生物屏障、機械屏障、免疫屏障3個角度研究。結果顯示：（1）與空白對照組比較，模型對照組大鼠糞便樣本中大腸桿菌和陰

10、溝腸桿菌的數量增高，而雙歧桿菌和乳酸桿菌數量呈下降趨勢；經消脂益肝方干預后大鼠腸道中大腸桿菌和陰溝腸桿菌數量呈下降趨勢，而雙歧桿菌和乳酸桿菌數量呈上升趨勢。（2）與空白對照組比較，Occludin、ZO-1蛋白的表達在模型對照組大鼠腸粘膜顯著下調；經消脂益肝方干預后Occludin、ZO-1蛋白的表達有所上調。此外，通過透射電鏡觀察到模型對照組大鼠回腸緊密連接縮短，橋粒結構疏松，線粒體水腫、內質網擴張，經脂益肝方干預后大鼠回腸緊密連接的

11、形態(tài)和完整性均得到一定的改善。（3）與空白對照組比較，模型對照組大鼠回腸TLR4、NF-κBp65蛋白表達顯著上調；經消脂益肝方干預后，而TLR4、NF-κBp65的表達水平呈下調趨勢。與空白對照組比較，模型對照組大鼠腸道粘液中SIgA的含量顯著下降，經消脂益肝方干預組大鼠腸道粘液中SIgA的含量升高。
　　結論：基于“從脾論治”立法的消脂益肝方在保肝降酶（AST、ALT），改善肝臟脂質代謝（TG、FFA）方面具有良好作用。同時，