脂筏介導副粘病毒入胞途徑的初步探討.pdf

1、目的：近年來的研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物細胞質(zhì)膜中存在著一些脂質(zhì)組成特異、有序的局限性結構，這些膜異質(zhì)性區(qū)域被稱為“微區(qū)”(microdomain)或“脂筏” (lipid raft)。而小窩(caveolae)因為具有燒瓶底型凹陷的形態(tài)和特殊的標記蛋白小窩蛋白(caveolin)成為脂筏重要的一個亞類，與其它類型的脂筏相區(qū)別。研究表明，脂筏參與了許多細胞外信號跨膜傳遞的過程，為膜外分子與膜受體結合提供一個微環(huán)境。同時脂筏或小窩還介導了細菌、病

2、毒甚至細菌毒素、朊病毒等感染細胞，成為近年來微生物領域研究的重點。要研究脂筏的作用，其前期工作就是分離提取純化脂筏并對其進行鑒定。本課題組已在實驗室成功分離脂筏，并經(jīng)鑒定證實，為今后的研究工作奠定堅實的基礎。此外，本課題組選用副粘病毒科成員副流感病毒．3(HPIV-3)和新城雞瘟病毒(NDV)初步探討了脂筏與病毒感染的關系，以期為今后找到不同病毒通過脂筏入胞的共性，尋找新的抗病毒藥物靶點，深入了解細胞內(nèi)吞的機制打下基礎。 方法：

3、 1、脂筏的分離提純與鑒定： 所有操作步驟均在0-4℃下進行。對照組用15mM甲基-β-環(huán)糊精預處理，其它操作步驟與實驗組相同。兩組細胞數(shù)均約為2×10<'8>個，離心收集細胞沉淀，在細胞團中加入裂解緩沖液，混勻后用Dounce勻漿器輕打10次，再放入冰盒上裂解30min后離心，離心后的上清為去核液約1ml，向去核液中加入2ml 60﹪的OptiPrep，使其終濃度為40﹪，將以上稀釋物小心放入離心管底部，用細胞裂解緩沖

4、液稀釋OptiPrep，使其終濃度分別為30﹪、25﹪、5﹪。按從高到低的順序逐層加入到離心管中，每個梯度均為2ml。4℃下超速離心，100 000g，5h。從上到下依次收集離心樣品9份，每份約1ml，行免疫印跡分析。 2、脂筏介導HPIV-3和NDV入胞的初步探討(1)HPIV-3和NDV分別經(jīng)雞胚增殖后測定效價，HPIV-3為1：640，NDV為1：1280。并測定兩種病毒的TCID<,50>：HPIV-3的。rCID<,50>為1

5、0<'4.2>/0.1ml：NDV的TCID<,50>為10<'5.3>/0.1ml。 (2)以CPE為指標觀察藥物干預后病毒對細胞的感染性：分別以濃度5mmol/L、10mmol/、15mmol/L的甲基-β-環(huán)糊精37℃作用于MDCK細胞單層30min，之后以100TCID<,50>/0.1ml的HPIv-3或NDv 37℃吸附1.5h，于37℃，5﹪CO<,2>孵箱培養(yǎng)4天。每日觀察特征性細胞病變(CPE)。按統(tǒng)計學方法計

6、算各組藥物處理后病毒感染細胞的百分比。 (3)以蝕斑法測定藥物干預后病毒對細胞的感染性：配制含0.75﹪瓊脂的無酚紅RPMI1640 50℃保溫備用。分別用5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L甲基-β-環(huán)糊精處理MDCK細胞單層30min，之后感染10<'5>的HPIV-3和10<'-7>NDV，37℃吸附1.5h，加第一層瓊脂，室溫固化后置37℃5﹪CO<'2>孵箱培養(yǎng)3天，第4天鋪第二層含中性紅的瓊脂培養(yǎng)基，避

7、光培養(yǎng)數(shù)小時或過夜，倒置顯微鏡下計數(shù)蝕斑數(shù)，并進行統(tǒng)計學分析。 (4)小窩形態(tài)和NDV吸附細胞部位的電鏡觀察。 結果： 1、經(jīng)離心和免疫印跡實驗，脂筏主要位于25-30﹪密度梯度離心界面中，存在于收集樣品中的第5、6、7管。小窩蛋白-1的分子量約為24KD，而對照組第5、6、7管未發(fā)現(xiàn)小窩蛋白-1。 2、以CPE為指標觀察藥物干預后病毒對細胞的感染性：甲基-β-環(huán)糊精對兩種病毒感染細胞均有一定抑制作用，且

8、隨著劑量的增加效果明顯提高。 3、以病毒蝕斑為指標觀察藥物干預后病毒對細胞的感染性：經(jīng)統(tǒng)計學分析， 10mmol/L甲基-β-環(huán)糊精和15mmol/L甲基-β-環(huán)糊精處理后病毒感染細胞的抑制效果均有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。盡管從數(shù)據(jù)上看NDV似乎更依賴脂筏進入細胞，但兩種病毒之間對通過脂筏感染細胞的區(qū)別沒有統(tǒng)計學意義。 4、透射電鏡下可見形態(tài)各異的凹陷狀小窩。NDV感染30分鐘，病毒吸附于細胞膜上一個小窩狀的凹陷內(nèi)，