傳染性支氣管炎病毒結(jié)合脂筏并通過網(wǎng)格蛋白依賴型內(nèi)吞入胞.pdf

1、禽傳染性支氣管炎(Avian infectous bronchitis，IB)是由禽傳染性支氣管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus，IBV)引起的一種雞的急性、高度接觸性呼吸道傳染病。主要以呼吸困難、氣管噦音、張口呼吸、咳嗽、打噴嚏為特征癥狀。腎病變型死亡率高，危害嚴(yán)重。傳染性支氣管炎病毒屬于冠狀病毒科（Coronaviridae）、冠狀病毒屬（Coronavirus）的Ⅲ型冠狀病毒，為單股正鏈不

2、分節(jié)段的RNA病毒。目前已知大部分的冠狀病毒主要通過內(nèi)吞方式入胞，包括SARS-CoV，MERS-CoV等嚴(yán)重威脅人類健康的病毒。研究表明IBV進(jìn)入BHK細(xì)胞主要依賴于內(nèi)體的酸性環(huán)境，但是具體的入胞方式和內(nèi)吞機(jī)制尚不清楚。本研究選擇Vero細(xì)胞為主要感染平臺(tái)，DF-1、H1299、Huh7和BHK細(xì)胞作為輔助研究平臺(tái)，采用多種實(shí)驗(yàn)方法鑒定IBV在細(xì)胞中的入胞和內(nèi)吞方式，以及胞內(nèi)運(yùn)輸途徑。
　　一、IBV通過網(wǎng)格蛋白依賴型內(nèi)吞方式進(jìn)

3、入細(xì)胞
　　利用網(wǎng)格蛋白依賴型內(nèi)吞抑制劑CPZ、小窩蛋白依賴型內(nèi)吞抑制劑Nystatin和巨胞飲抑制劑Amiloride分別預(yù)處理細(xì)胞，IBV感染。發(fā)現(xiàn)CPZ的處理顯著降低了IBV入胞、病毒蛋白表達(dá)、子代病毒的釋放(p＜005)，而Nystatin和Amiloride的處理對(duì)IBV入胞和后續(xù)的病毒復(fù)制和子代病毒的釋放沒有明顯影響。利用siRNA干擾動(dòng)力蛋白Dynamin1和網(wǎng)格蛋白重鏈CHC的表達(dá)，阻止網(wǎng)格蛋白內(nèi)吞小體的脫落或者形

4、成，IBV的入胞、病毒復(fù)制和子代病毒的釋放都發(fā)生顯著下降(p＜005)。利用過表達(dá)Dynamin1的顯性負(fù)突變體阻止內(nèi)吞小體從細(xì)胞膜的脫落，發(fā)現(xiàn)IBV的入胞、蛋白表達(dá)、以及子代病毒的釋放都有顯著下降(p＜005)。以上結(jié)果表明IBV通過網(wǎng)格蛋白依賴型內(nèi)吞方式進(jìn)入細(xì)胞。
　　二、IBV通過結(jié)合到脂筏進(jìn)入細(xì)胞
　　在IBV感染過程中，用藥物MβCD破壞細(xì)胞膜上的脂筏，發(fā)現(xiàn)在病毒感染前破壞脂筏，顯著降低了病毒的入胞、后續(xù)的蛋白表達(dá)

5、和子代病毒的釋放(p＜005)。在感染前用MβCD破壞脂筏，再補(bǔ)充膽固醇恢復(fù)脂筏的形成，發(fā)現(xiàn)病毒的入胞和復(fù)制得到一定程度的恢復(fù)。脂筏分離實(shí)驗(yàn)證明病毒顆粒確實(shí)結(jié)合到了脂筏上。為了直觀觀察病毒入胞與脂筏的關(guān)系，用染料R18標(biāo)記病毒，感染細(xì)胞，再用抗體標(biāo)記脂筏，免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn)IBV在感染時(shí)首先結(jié)合到細(xì)胞膜表面的脂筏。以上結(jié)果表明IBV感染時(shí)能結(jié)合細(xì)胞膜脂筏，且依賴于脂筏入胞。
　　三、IBV入胞過程引起細(xì)胞骨架重排
　　用R18

6、標(biāo)記的IBV感染細(xì)胞，鬼筆環(huán)肽標(biāo)記肌動(dòng)蛋白，免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn)IBV入胞后與肌動(dòng)蛋白共定位，且從形態(tài)學(xué)上觀察到細(xì)胞骨架微絲在感染過程中發(fā)生解聚，然后恢復(fù)聚合。用肌動(dòng)蛋白合聚合抑制劑Cyt D和穩(wěn)定劑Jas處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)能明顯提高IBV的入胞以及后續(xù)的蛋白表達(dá)。以上結(jié)果表明IBV入胞能夠引起細(xì)胞骨架重排。
　　四、IBV在細(xì)胞內(nèi)吞小體中的運(yùn)輸和膜融合
　　用R18標(biāo)記的病毒感染細(xì)胞，免疫熒光觀察發(fā)現(xiàn)，IBV進(jìn)入細(xì)胞后會(huì)沿著早期內(nèi)

7、體、晚期內(nèi)體，最終到達(dá)溶酶體。用R18和DIOC標(biāo)記的病毒感染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)IBV在進(jìn)入晚期內(nèi)體和溶酶體后發(fā)生囊膜與內(nèi)體膜的融合（在膜融合過程中R18和DIOC信號(hào)發(fā)生分離），釋放基因組到細(xì)胞質(zhì)中。本實(shí)驗(yàn)還構(gòu)建了Rab5和Rab7的野生型質(zhì)粒、顯性負(fù)突變體質(zhì)粒和持續(xù)激活突變質(zhì)粒。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Rab5和Rab7顯性負(fù)突變體質(zhì)粒，干擾早期內(nèi)體和晚期內(nèi)體的成熟，能夠顯著降低病毒入胞數(shù)量和病毒蛋白的表達(dá)(p＜005)。通

8、過干擾Rab5和Rab7的表達(dá)，能減少早期內(nèi)體和晚期內(nèi)體的形成，同樣可以降低病毒的入胞數(shù)量和后續(xù)的蛋白表達(dá)(p＜005)。以上結(jié)果說(shuō)明，IBV入胞后沿著內(nèi)體系統(tǒng)運(yùn)輸，在晚期內(nèi)體和溶酶體中發(fā)生膜融合。
　　綜上所述，IBV結(jié)合到細(xì)胞表面的脂筏，利用網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑進(jìn)入細(xì)胞，同時(shí)引起細(xì)胞骨架的重排，然后沿著內(nèi)體系統(tǒng)運(yùn)輸，在晚期內(nèi)體和溶酶體發(fā)生融合，釋放病毒粒子進(jìn)入胞漿，開啟后續(xù)的復(fù)制過程。以上結(jié)果解析了IBV感染細(xì)胞的分子機(jī)制，