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文檔簡介
1、戊型肝炎病毒(HEV)為無包膜正二十面體單鏈正義RNA病毒,主要經(jīng)糞口途徑傳播,往往在發(fā)展中國家造成爆發(fā)流行,在發(fā)達國家導(dǎo)致散發(fā)流行。戊型肝炎的病死率為0.2-4%,孕婦病死率則高達10-20%,且越來越多的證據(jù)表明其可能是一種人獸共患病,給人類身體健康造成極大的危害。HEV由于一直缺乏穩(wěn)定有效的細胞感染模型,其感染入胞機制及其致病機理至今仍不清楚。本論文利用能較好模擬HEV表面結(jié)構(gòu)的HEV衣殼蛋白片段p239為模型,構(gòu)建p239相互作
2、用蛋白篩選平臺,篩選可能參與HEV入胞過程的宿主細胞蛋白,為揭示HEV感染入胞機制提供線索。 p239為HEV pORF2(aa368-606)片段,原核表達能自組裝成15-30nm的蛋白顆粒,與戊型肝炎患者急性期血清反應(yīng)性良好,免疫恒河猴可以完全預(yù)防HEV導(dǎo)致的戊型肝炎。p239孵育HepG2細胞,能特異性的吸附并侵入細胞,且被p239中和單抗8C11阻斷。p239與野生1型HEV共孵育細胞,能阻斷HEV感染HepG2和人原代
3、肝細胞,表明p239能較好模擬HEV表面結(jié)構(gòu)。 利用p239較好模擬HEV表面結(jié)構(gòu)的特性,將其作為蛋白親合層析的配體/誘餌蛋白,借助鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽(Calmodulin binding peptide,CBP)與鈣調(diào)蛋白的特異性結(jié)合將其固定于瓊脂糖固相介質(zhì),親合層析體外篩選HepG2細胞、猴肝組織中與其相互作用的蛋白,獲得的候選蛋白樣品采用二維電泳進行分離,挖取特異的候選蛋白點,膠內(nèi)原位酶切,MALDI-TOF-MS分析鑒定,確
4、定六個候選蛋白:Grp78、HSP90、α-tubulin、p43、ATPase beta subunit、unamed orotein。免疫共沉淀初步確定p239與Grp78、HSP90、α-tubulin之間的特異性相互作用。 有研究發(fā)現(xiàn)Grp78分布于細胞膜表面參與柯薩奇病毒、登革熱病毒的入胞。為了進一步研究p239與Grp78的相互作用,原核表達、純化p239、Grp78,免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)二者之間的特異性相互作用為直接
5、結(jié)合,且原核表達純化的Grp78-his pnll down實驗進一步佐證了二者的直接相互作用,還發(fā)現(xiàn)ATP可以解離二者的結(jié)合,這一系列證據(jù)充分說明二者的結(jié)合是直接的、可逆的生理性結(jié)合。將p239的C端缺失6個氨基酸得到p233,p233并不與Grp78結(jié)合,表明p239通過構(gòu)象位點與Grp78結(jié)合。中和抗體8C11阻斷結(jié)合實驗發(fā)現(xiàn)二者的結(jié)合位點與p239的主要免疫優(yōu)勢表位8C11存在區(qū)域重疊。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)Grp78同樣存在于He
6、pG2細胞表面;激光共聚焦顯微鏡發(fā)現(xiàn)p239與HepG2細胞膜表面的Grp78存在部分共定位;且原核表達純化的Grp78、Grp78-his以及抗Grp78鼠多抗血清都能部分阻斷p239對宿主細胞的吸附。 綜上所述,我們得出以下結(jié)論: 1.p239可以吸附并侵入宿主細胞,這種吸附可以被8C11特異性阻斷:且p239競爭性抑制HEV對HepG2及人原代肝細胞的感染,表明p239較好的模擬HEV表面結(jié)構(gòu),可以作為HEV模型用
7、于病毒與宿主細胞相互作用研究。 2.以p239-CBP為誘餌蛋白篩選宿主細胞中的相互作用蛋白,獲得Grp78、HSP90、α-tubulin、p43、ATPase beta subunit、unamed protein六個候選蛋白,免疫共沉淀初步確定p239與Grp78、HSP90、α-tubulin之間的特異性相互作用,表明以p239為靶蛋白的相互作用蛋白篩選平臺具有可行性。 3.原核表達純化的Grp78、Grp78-
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