根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)甲型肝炎病毒（HAV）衣殼蛋白融合基因轉(zhuǎn)化柑桔的研究.pdf

1、柑桔是世界上最重要的果樹樹種之一，目前全世界柑桔種植面積1億余畝，年總產(chǎn)1億噸以上，柑桔年貿(mào)易額近70億美元。柑桔也是我國最大宗的水果，2004年栽培面積2441萬畝，居世界首位，總產(chǎn)量1496萬噸，僅次于巴西、美國居第三位，產(chǎn)值150余億元。柑桔業(yè)現(xiàn)已成為我國南方廣大山區(qū)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè)之一，在農(nóng)民致富奔小康、山區(qū)水土保持和三峽庫區(qū)移民安置中發(fā)揮了重要作用。 世界各國在發(fā)展柑桔生產(chǎn)的同時，也始終注重柑桔品種的質(zhì)量和改良，尤其是

2、象中國這樣的發(fā)展中國家，柑桔的消費結(jié)構(gòu)正在發(fā)生質(zhì)的轉(zhuǎn)變，由通常的賣方市場轉(zhuǎn)向買方市場，消費趨向于高檔次、高品質(zhì)和多樣化，從而為柑桔品種改良提出了更多、更高、更新的要求。然而，由于柑桔類果樹童期長，遺傳背景高度雜合、基因間緊密連鎖、珠心胚和嵌合體的干擾以及某些品種間有性不親和等，使得常規(guī)育種的育種周期長、育種效率低，難以滿足現(xiàn)代柑桔業(yè)品種更新的需求。近年來，植物基因工程的迅速發(fā)展為柑桔品種改良開辟了一條新途徑，使短期內(nèi)進(jìn)行柑桔品種的定向改

3、良成為可能。柑桔遺傳轉(zhuǎn)化研究始于20世紀(jì)80年代，到目前為止已有不少報道，但就現(xiàn)有的報道中，在外植體的選擇上，主要是采用實生苗的上胚軸、莖段等童質(zhì)材料，這對于改良某些無核品種(如不知火)來說，受到了很大的限制，同時對于改良某些有核品種來說，其生產(chǎn)應(yīng)用要經(jīng)過很長的童期。以柑桔成年樹腋芽為外植體材料則可以解決這一問題。 甲型病毒性肝炎簡稱甲型肝炎，是由甲型肝炎病毒(HAV)引起的一種傳染病。甲型肝炎患者、亞臨床感染者是甲型肝炎的主要

4、傳染源。人對HAV普遍易感，感染后可獲得持久的免疫力。長期實踐證實，一般隔離預(yù)防措施對甲肝難以見效，較長時期內(nèi)預(yù)防甲肝的暴發(fā)或流行任務(wù)仍十分艱巨，因此，疫苗的使用是甲肝防治的根本出路。 隨著近年來植物生物技術(shù)的飛速發(fā)展，為利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)可食(飼)疫苗的研究和應(yīng)用開辟了新天地。目前，國內(nèi)外已有100多種外源蛋白或多肽在植物中成功表達(dá)，而利用香蕉、番茄表達(dá)抗原的人用疫苗和運(yùn)用動物飼料如馬鈴薯、苜蓿、煙草、谷物類等植物表達(dá)的獸用疫

5、苗以其獨特的優(yōu)勢，成為疫苗研究的熱點。 解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)成功分離、克隆了HAV衣殼蛋白融合基因，并構(gòu)建了相應(yīng)的真核表達(dá)載體系統(tǒng)；以真核細(xì)胞(中國倉鼠腎細(xì)胞，CHO)表達(dá)的HAV衣殼蛋白作為口服疫苗進(jìn)行動物(小鼠)試驗，獲得了很好的免疫效果。因此，本論文擬以柑桔成年樹腋芽作為遺傳轉(zhuǎn)化的起始材料，建立一個高頻再生體系，通過農(nóng)桿菌的介導(dǎo)，獲得轉(zhuǎn)HAV衣殼蛋白融合基因柑桔材料。本論文的順利完成將進(jìn)一步完善通過轉(zhuǎn)基因方法培育柑桔新品種的

6、技術(shù)體系，同時為食用‘甲肝疫苗型’轉(zhuǎn)基因柑桔篩選奠定材料基礎(chǔ)。 主要工作和研究結(jié)果如下：1.柑桔成年樹腋芽的試管嫁接通過柑桔田間成年樹枝條不同成熟度和消毒時間對腋芽試管嫁接成活率的影響進(jìn)行比較，建立了柑桔成年樹腋芽試管嫁接再生的技術(shù)體系。研究結(jié)果表明，柑桔成年樹腋芽的試管嫁接成活率與枝條的成熟度和消毒時間有明顯的關(guān)系：消毒時間太長或太短，木質(zhì)化和半木質(zhì)化的枝條其腋芽的嫁接成活率都很低；木質(zhì)化的枝條消毒12min左右、半木質(zhì)化的枝

7、條消毒8min左右，其腋芽嫁接成活率最高，達(dá)到80﹪左右。 2.建立了以柑桔成年樹腋芽為受體的遺傳轉(zhuǎn)化方法通過對成年樹腋芽的試管嫁接、創(chuàng)傷以及不定芽的誘導(dǎo)，建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的柑桔成年樹腋芽的遺傳轉(zhuǎn)化方法。將柑桔試管嫁接苗去除頂芽并對腋芽進(jìn)行完全創(chuàng)傷，用含有BA5mg/L和IAA2.5mg/L的農(nóng)桿菌懸浮液的小棉球浸染傷口，在黑暗的條件下培養(yǎng)2～3d；去掉小棉球，光照條件下繼續(xù)培養(yǎng)至不定芽長約1.0cm。將不定芽嫁接于15d齡