鴿Ⅰ型副粘病毒Pi-CH-LHLJ-110822弱毒株拯救及免疫效力初步評價.pdf

1、鴿新城疫（Newcastle disease,ND）是嚴(yán)重危害養(yǎng)鴿業(yè)的病毒性傳染病，其病原為鴿Ⅰ型副黏病毒（Pigeon Paramyxovirus typeⅠ, PPMV-1），又稱為鴿新城疫病毒。在新城疫病毒（NDV）的基因分型中，PPMV-1雖然與目前常規(guī)疫苗毒株同處于classⅡ系中，但PPMV-1在系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹上形成了一個獨(dú)立分支-基因Ⅵb型，而傳統(tǒng)疫苗毒株屬于基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，與基因Ⅵb型抗原性差異較大，導(dǎo)致現(xiàn)有疫苗免疫鴿

2、后保護(hù)效果不佳。反向遺傳學(xué)操作技術(shù)可以對病毒基因組進(jìn)行突變、缺失或外源基因插入修飾等，從而快速獲得毒力致弱毒株，可用于研制基因Ⅵb型的鴿新城疫專用疫苗。
　　鴿 I型副黏病毒 Pi/CH/LHLJ/110822（Pi110822）為2011年分離自黑龍江省（ICPI=1.19， MDT=63h），是我國目前鴿中流行毒株。Pi110822毒株基因組DNA已經(jīng)完整地克隆至pUC18載體，基因組10176nt位置構(gòu)建了遺傳標(biāo)記（NheI

3、酶切位點(diǎn)）。本研究在此基礎(chǔ)之上，將pUC18中的基因組通過In-Fusion技術(shù)亞克隆至pOLTV5載體中，構(gòu)建了含有Pi110822全長基因組cDNA的質(zhì)粒pOLTV5-0822FL，與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BSR-T7/5細(xì)胞，拯救出了新城疫病毒r0822。鑒定結(jié)果表明，拯救病毒遺傳標(biāo)記存在，毒力、在雞胚成纖維細(xì)胞和雞胚上的生長特性與親本毒相近，從而成功構(gòu)建了Pi110822毒株的反向遺傳操作平臺。
　　研究表明，新城疫病毒的F蛋白裂

4、解位點(diǎn)的氨基酸組成是其毒力主要決定因素。依據(jù)這一特點(diǎn)，將pOLTV5-0822FL質(zhì)粒中病毒基因組進(jìn)行改造，分別構(gòu)建了F蛋白裂解位點(diǎn)突變?yōu)橐呙缰闘aSota相應(yīng)序列的重組質(zhì)粒，以及Pi110822的F基因替換為LaSota F基因的重組質(zhì)粒，并成功拯救出F蛋白裂解位點(diǎn)突變毒株（Pi110822-FCS）和F基因替換毒株（Pi110822-LAF）。鑒定結(jié)果表明， Pi110822-FCS毒株與Pi110822-LAF毒株的ICPI值均由

5、親本毒的1.19降低為0，MDT由63h增加為大于168h，表明兩株拯救病毒的毒力降低，由中等毒力毒株變?yōu)槿醵局?。Pi110822-FCS與Pi110822-LAF分別感染的第5、10、15、20代的雞胚尿囊液測定HA效價，然后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增測序，結(jié)果表明突變位點(diǎn)經(jīng)20代連續(xù)傳代仍穩(wěn)定存在，具有遺傳穩(wěn)定性。
　　為篩選免疫原性良好的鴿新城疫弱毒疫苗株，對兩株弱毒株的安全性和免疫原性進(jìn)行了初步評估。安全性評價試驗(yàn)結(jié)果表明，2株

6、病毒的尿囊液原液免疫3日齡SPF雞后，在觀察的15天內(nèi)未出現(xiàn)發(fā)病和死亡，安全性良好。由于鴿新城疫病毒（Ⅵ型）對雞均為中等毒力或低毒力毒株，所以選用基因Ⅶ型強(qiáng)毒株 NDV/HLJ/01/06株攻毒免疫的 SPF雞，Pi110822-FCS組發(fā)病率為72.72％(8/11)，死亡率為54.54%(6/11)，Pi110822-LAF組發(fā)病率為50%(5/10)，死亡率為20%(2/10)，對照組全部死亡。攻毒毒株為基因Ⅶ型，與免疫毒株（基因

7、Ⅵ型）抗原性差異較大，仍能起部分交叉保護(hù)作用。將Pi110822-FCS滅活后免疫20日齡SPF雞，兩周抗體HI效價能達(dá)到7.5±1.12，三周時HI效價達(dá)到9.1±1，表明作為滅活苗可在雞體內(nèi)刺激產(chǎn)生高水平血清抗體。
　　本研究還進(jìn)行了 Pi110822-FCS在鴿上的免疫保護(hù)試驗(yàn)，但由于鴿未完成凈化，本身攜帶新城疫病毒，導(dǎo)致試驗(yàn)數(shù)據(jù)無法使用。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合分析表明，本研究所拯救的2株P(guān)PMV-1弱毒株，可以作為鴿用疫苗候選株