結(jié)締組織生長(zhǎng)因子單鏈抗體的構(gòu)建及其對(duì)胰腺癌細(xì)胞的作用.pdf

1、背景:結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor;CTGF),是即刻早期基因CCN家族中的成員,又名CCN2,是Bradham等1991年從人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中分離出來的,由349個(gè)氨基酸殘基組成的,富含半胱氨酸的結(jié)合肝素的分泌性多肽,相對(duì)分子質(zhì)量為38000,由高爾基體分泌。CTGF分子含有4個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)區(qū)域即(1)胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合區(qū)(IGFBP),因含能與胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合的序列而得以命

2、名;(2)C型血管假性血友病因子重復(fù)區(qū)(VWC);(3)血小板反應(yīng)蛋白1重復(fù)區(qū)(TSP1);(4)富含半胱氨酸羧基末端(CT)。在生理劑量下,CTGF發(fā)揮著調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、增殖、分化、轉(zhuǎn)移,促進(jìn)血管生成,創(chuàng)傷修復(fù),軟骨生成和骨生成的作用,是機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育過程中不可缺少的細(xì)胞因子。但 CTGF的高表達(dá)及異位表達(dá),與瘢痕形成,病理性纖維化,腫瘤形成等多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān),多種癌癥的治療已把 CTGF作為靶點(diǎn);美國(guó)臨床腫瘤協(xié)會(huì)2011年會(huì)中把C

3、TGF作為攻克胰腺癌的候選靶點(diǎn)。因此,CTGF的抗體在今后的生命科學(xué)領(lǐng)域會(huì)發(fā)揮越來越大的作用。
　　噬菌體展示技術(shù)的原理是將外源目的基因插入噬菌體編碼蛋白衣殼的基因組中,使目的基因編碼的蛋白表達(dá)在噬菌體的衣殼上,并通過擴(kuò)增與生物淘選,使目的蛋白得到富集并被篩選出來。噬菌體展示技術(shù)廣泛應(yīng)用于疫苗的研制,醫(yī)學(xué)診斷和治療、酶抑制劑的篩選,多肽藥物的開發(fā)、蛋白質(zhì)相互作用的研究等,并顯示了良好的應(yīng)用前景本實(shí)驗(yàn)中通過噬菌體展示技術(shù)合成 CTG

4、F單鏈抗體的定向庫(kù),通過親和篩選獲得CTGF單鏈抗體,克服了生物工程制成的單抗親和力可能會(huì)不高的缺點(diǎn)。定向庫(kù)篩選,與大容量隨機(jī)庫(kù)篩選相比,假陽(yáng)性率更低。通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn),合成的單鏈抗體對(duì)胰腺癌的增殖凋亡有作用,為抗胰腺癌藥物合成增加了一個(gè)新途徑。
　　目的:通過免疫小鼠獲得抗CTGF抗體的基因,構(gòu)建CTGF單鏈抗體展示文庫(kù),通過生物淘選獲得CTGF的單鏈抗體。并作用于胰腺癌細(xì)胞系PANC-1細(xì)胞,觀察單鏈抗體對(duì)PANC-1細(xì)胞的影響

5、。
　　方法:用重組人CTGF(rhCTGF)免疫balb/c小鼠,小鼠表達(dá)CTGF抗體后取脾臟獲得B細(xì)胞,提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄為cNDA,PCR擴(kuò)增出小鼠含有CTGF抗體基因的重鏈及輕鏈可變區(qū)基因VH和VL,然后VH和VL再次PCR裝配為vl-linker-vh基因片段。組裝好的片段和噬菌粒PAK100經(jīng)SfiⅠ酶切后通過T4連接酶連接,形成含有抗CTGF單鏈抗體基因的目的噬菌粒。目的噬菌粒電轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Xle-blue,加入

6、輔助噬菌體擴(kuò)增后,建立噬菌體展示庫(kù)。噬菌體庫(kù)與包被在96孔板上的CTGF結(jié)合,先洗去非特異性結(jié)合的噬菌體,再把特異性結(jié)合的噬菌體洗脫下來進(jìn)行擴(kuò)增,如此四輪之后,特異性結(jié)合的噬菌體就會(huì)得到富集,富集的噬菌體感染 xle-blue菌并涂布在相應(yīng)抗性的固體培養(yǎng)基上。挑單克隆用ELISA方法檢測(cè)其親和力,測(cè)定高親和力的克隆的基因序列。將高親和序列擴(kuò)增,制成抗CTGF單鏈抗體,作用于panc-1細(xì)胞,用MTT實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn),通過與陽(yáng)性對(duì)照,陰

7、性對(duì)照,空白對(duì)照的對(duì)比,觀察單鏈抗體對(duì)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)及凋亡的影響。
　　結(jié)果:小鼠免疫成功,提RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA,作為模版擴(kuò)增單鏈抗體基因,經(jīng)電泳證實(shí),VH,VL成功擴(kuò)增,CTGF單鏈抗體噬菌體展示庫(kù)成功構(gòu)建,經(jīng)過四輪篩選,CTGF單鏈抗體富集了2000倍。ELISA檢測(cè)單鏈抗體與CTGF的親和力后,得到了10個(gè)高親和力的克隆,經(jīng)測(cè)序,10個(gè)克隆的基因序列相似度達(dá)到82％,其中兩個(gè)克隆的序列完全一致,作為實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物,用于后續(xù)實(shí)

8、驗(yàn)。MTT及流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí),單鏈抗體抑制胰腺癌panc-1細(xì)胞的增殖,促進(jìn)胰腺癌panc-1細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)論:通過動(dòng)物免疫的方法,構(gòu)建的CTGF單鏈抗體的定向展示文庫(kù),與隨機(jī)庫(kù)相比,定向庫(kù)中含有大量靶目標(biāo)的基因,提高了篩選成功的可能性。經(jīng)過四輪的篩選,得到CTGF單鏈抗體。因篩選過程為與目的蛋白結(jié)合的親和篩選,實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物為高親和力抗人CTGF單鏈抗體?？谷薈TGF單鏈抗體的成功合成,并對(duì)胰腺癌細(xì)胞有一定作用,為合成新的治療胰