大白菜硫甙合成基因特異SSR標記的開發(fā)和應用.pdf

1、硫代葡萄糖甙(簡稱硫甙，Glucosinolate)是十字花科重要的一種次生代謝產物，是白菜類作物（Brassica campetris syn.rapa，2n=20）中的重要營養(yǎng)物質成分。但是，直接測定硫甙含量費時費力，在育種過程中不宜直接選擇。有必要在分子水平上對硫甙含量和不同組分的變異特點進行研究，從而能夠進一步發(fā)掘優(yōu)異基因資源。
　　本研究根據(jù)大白菜基因組序列信息，針對大白菜硫甙合成相關的所有基因開發(fā)特異SSR位點，分析其

2、重復類型和分布特點;結合開發(fā)出的分布于全基因組水平的InDel標記，分析在75份不同類型的大白菜自交系中擴增的效果和多態(tài)性水平;通過HPLC（高效液相色譜）方法分別在苗期（定植后35天）和成熟期（適宜采收期）測定葉片硫甙含量，解析其變異特點;通過關聯(lián)分析，獲悉與大白菜硫甙含量相關的SSR等位基因或位點及InDeL標記。為分子標記輔助選擇育種提供基礎材料，加快大白菜營養(yǎng)品質育種的進程。主要研究結果如下:
　　1.比對擬南芥和大白菜硫

3、甙生物合成相關基因的序列信息，發(fā)現(xiàn)擬南芥的52個硫甙合成基因在大白菜中的同源基因個數(shù)分別為:零拷貝基因8個、單拷貝基因13個、2拷貝基因17個、2個以上多拷貝基因14個。
　　2.根據(jù)102個大白菜硫甙生物合成相關基因的上下游序列各5kb，共開發(fā)出237個SSR位點:16個基因沒有發(fā)現(xiàn)SSR位點，72個基因存在1～4個SSR位點，5個基因存在5個SSR位點，4個基因存在6個SSR位點，4個基因存在7個SSR位點，1個基因存在8個S

4、SR位點;所開發(fā)的SSR位點中，共發(fā)現(xiàn)4種重復類型，其中單核苷酸重復最多，共122個，占SSR總數(shù)的51.4％。其次是二核苷酸類型，共48個，占SSR總數(shù)的20.3％。三核苷酸重復類型最少，共7個，占SSR總數(shù)的3.0％。另外60個SSR無明顯的重復類型。
　　3.具有SSR位點的86個基因中，77個基因可以設計特異SSR引物。其中，49對特異引物在大白菜自交系中得到有效擴增，16對引物具有多態(tài)性，占全部引物的20.8％;18對引

5、物無多態(tài)性，占全部引物的23.4％;15對引物雜帶多，占全部引物的19.5％;另外28對引物無擴增產物，占全部引物的36.4％。最終，11對在供試的75份材料中獲得了清晰多態(tài)性擴增產物,共檢測出26個等位基因，平均每對引物檢測到等位基因2.4個。
　　4.開發(fā)設計的177對InDel引物，161對在供試的75份大白菜自交系中得到有效擴增，占全部引物的91.0％;61對獲得了清晰多態(tài)性擴增產物，占全部引物的34.5％;61對引物共檢

6、測到161個多態(tài)性帶，平均每對引物檢測到2.6條帶。其中，95對引物只檢測到1條擴增帶，31對檢測到2條擴增帶，24對檢測到3條擴增帶，6對檢測到4條擴增帶。
　　5.在苗期，測定了68份大白菜自交系的葉片硫甙含量。結果表明不同基因型間各硫甙間含量差異較大，總硫甙含量變異幅度為0.734-11.189μmol/g DW;吲哚族硫甙平均含量高于脂肪族硫甙和芳香族硫甙，所占比例分別為49.9％、39.8％和10.6％。其中，3-吲哚-

7、甲基硫甙(GBC)含量最高，占總硫甙含量的27.0％;4-甲氧基-3-吲哚甲基硫甙(4ME)和4-戊烯基硫甙(GBN)含量較高，分別占總硫甙含量的18.0％和15.9％;4-羥基-3-吲哚-甲基硫甙(4OH)含量最低，僅占硫甙總含量的0.6％。
　　6.在成熟期，測定了68份大白菜自交系的葉片硫甙含量。結果表明不同基因型間各硫甙間含量差異較大，總硫甙含量變異幅度為1.918-17.357μmol/g DW;脂肪族硫甙和吲哚族硫甙的

8、平均含量高于芳香族硫甙，所占比例分別為48.6％、41.7％和9.7％。其中，2-羥基-3-丁烯基硫甙(PRO)、4-戊烯基硫甙(GBN)、4-甲氧基-3-吲哚甲基硫甙(4ME)和3-吲哚-甲基硫甙(GBC)含量相當，分別占總硫甙含量的19.8％、19.7％、19.6％和19.0％。4-羥基-3-吲哚-甲基硫甙(4OH)含量最低，僅占硫甙總含量的0.7％。成熟期總硫甙和各個成分含量明顯高于苗期，相差約2倍。
　　7.GLM關聯(lián)分析