PD-1對膿毒癥小鼠肝臟枯否細(xì)胞功能的影響與機(jī)制研究.pdf

1、[研究目的]
　　 膿毒癥是感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，死亡率一直居高不下。免疫抑制是膿毒癥后期常見的免疫異常狀態(tài)。巨噬細(xì)胞功能障礙是這種免疫抑制的一個重要原因，但是其具體發(fā)生機(jī)制目前尚不明了。
　　 程序性死亡分子1(programmed cell death1，PD-1)是近年來發(fā)現(xiàn)的共抑制受體，參與外周組織免疫耐受和慢性病毒感染。PD-1基因敲除可以顯著提高膿毒癥小鼠的生存率，提示PD-1在膿毒癥免疫抑制中發(fā)揮著

2、重要的作用。本課題擬首先檢測PD-1在肝臟枯否細(xì)胞的表達(dá)，進(jìn)而應(yīng)用PD-1基因敲除小鼠，觀察PD-1在膿毒癥肝臟枯否細(xì)胞功能障礙的作用，并初步探索PD-1在枯否細(xì)胞發(fā)揮作用的分子機(jī)制及PD-1參與膿毒癥多器官功能障礙的分子機(jī)制。
　　 [研究方法]
　　 1、復(fù)制盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture，CLP)致膿毒癥小鼠模型。將16只野生型C57BL/6小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham，n=

3、8）和CLP組(CLP, n=8)。術(shù)后24 h時(shí)取肝臟，分離肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測枯否細(xì)胞(F4/80+)表面PD-1的表達(dá)水平。
　　 2、將10只野生型C57BL/6小鼠及10只PD-1基因敲除小鼠隨機(jī)分為野生型假手術(shù)組（WT Sham，n=4），PD-1基因敲除假手術(shù)組（PD-1-/-Sham，n=4），野生型CLP組(WT CLP, n=6)和PD-1基因敲除CLP組（PD-1-/--CLP, n=6）。術(shù)

4、后24 h時(shí)，分離肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測枯否細(xì)胞表面MHC(Ⅱ)、CD69、CD80和CD86的表達(dá)水平。
　　 3、將8只野生型C57BL/6小鼠及8只PD-1基因敲除小鼠隨機(jī)分為野生型假手術(shù)組（WT Sham，n=4），PD-1基因敲除假手術(shù)組（PD-1-/-Sham，n=4），野生型CLP組(WT CLP, n=4)和PD-1基因敲除CLP組(PD-1-/-CLP, n=4)。術(shù)后24 h時(shí)，分離肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞

5、，貼壁法純化枯否細(xì)胞。加入分子探針pHrodoTME.coli BioParticlesConjugate共培養(yǎng)1h，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測枯否細(xì)胞吞噬功能。
　　 4、將10只野生型C57BL/6小鼠及10只PD-1基因敲除小鼠隨機(jī)分為野生型假手術(shù)組（WT Sham，n=4），PD-1基因敲除假手術(shù)組（PD-1-/-Sham，n=4），野生型CLP組(WT CLP, n=6)和PD-1基因敲除CLP組（PD-1-/-CLP, n=

6、6）。術(shù)后24 h時(shí)，分離肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，貼壁法純化枯否細(xì)胞。LPS（1μg/ml）刺激或不刺激24 h后收集培養(yǎng)上清及細(xì)胞，ELISA法檢測細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-12p40和MCP-1水平。
　　 5、將10只野生型C57BL/6小鼠及10只PD-1基因敲除小鼠隨機(jī)分為野生型假手術(shù)組（WT Sham，n=4），PD-1基因敲除假手術(shù)組（PD-1-/-Sham，n=4），野生型CLP組(WT

7、 CLP, n=6)和PD-1基因敲除CLP組（PD-1-/-CLP, n=6）。術(shù)后24 h時(shí)，分離肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，貼壁法純化枯否細(xì)胞。LPS（1μg/ml）刺激24 h后收集細(xì)胞，Westernblot法檢測cleaved caspase-3的水平。
　　 6、將10只野生型C57BL/6小鼠及10只PD-1基因敲除小鼠隨機(jī)分為野生型假手術(shù)組（WT Sham，n=4），PD-1基因敲除假手術(shù)組（PD-1-/-Sham，n=4

8、），野生型CLP組(WT CLP, n=6)和PD-1基因敲除CLP組（PD-1-/-CLP, n=6）。術(shù)后24 h時(shí)，分離肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，貼壁法純化枯否細(xì)胞。LPS(1μg/ml)刺激24 h后收集細(xì)胞，TUNEL法檢測凋亡情況。
　　 7、將10只野生型C57BL/6小鼠及10只PD-1基因敲除小鼠隨機(jī)分為野生型假手術(shù)組（WT Sham，n=4），PD-1基因敲除假手術(shù)組（PD-1-/-Sham，n=4），野生型CLP組(

9、WT CLP, n=6)和PD-1基因敲除CLP組（PD-1-/-CLP, n=6）。術(shù)后24 h時(shí)，分離肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，貼壁法純化枯否細(xì)胞。LPS(1μg/ml)刺激10 min后收集細(xì)胞，Western blot法檢測磷酸化Akt及總Akt水平。
　　 8、將10只野生型C57BL/6小鼠及10只PD-1基因敲除小鼠隨機(jī)分為野生型假手術(shù)組（WT Sham，n=4），PD-1基因敲除假手術(shù)組（PD-1-/-Sham，n=4），

10、野生型CLP組(WT CLP, n=6)和PD-1基因敲除CLP組（PD-1-/-CLP, n=6）。術(shù)后24 h時(shí)，分離肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，貼壁法純化枯否細(xì)胞。LPS（1μg/ml）刺激10 min后收集細(xì)胞，Western blot法檢測磷酸化p38及總p38水平。
　　 9、將10只野生型C57BL/6小鼠及10只PD-1基因敲除小鼠隨機(jī)分為野生型假手術(shù)組（WT Sham，n=4），PD-1基因敲除假手術(shù)組（PD-1-/-Sh

11、am，n=4），野生型CLP組(WT CLP, n=6)和PD-1基因敲除CLP組（PD-1-/-CLP, n=6）。術(shù)后24 h時(shí)，取心臟、肝臟和腎臟。組織勻漿，Western blot法檢測磷酸化Akt、總Akt、磷酸化STAT3和總STAT3水平。
　　 [結(jié)果]
　　 1、術(shù)后24 h時(shí)，膿毒癥小鼠肝臟枯否細(xì)胞表面PD-1表達(dá)顯著高于假手術(shù)組(P＜0.001).
　　 2、術(shù)后24 h時(shí)，野生型膿毒癥小鼠

12、肝臟枯否細(xì)胞表面MHC(Ⅱ)、CD86表達(dá)均顯著低于野生型假手術(shù)組(P＜0.001)，CD80表達(dá)顯著高于野生型假手術(shù)組(P＜0.001)。 PD-1基因敲除可部分但顯著恢復(fù)枯否細(xì)胞表面MHCH、CD80和CD86表達(dá)(P＜0.001)。各組CD69表達(dá)無顯著改變。
　　 3、術(shù)后24 h時(shí)，野生型膿毒癥小鼠肝臟枯否細(xì)胞吞噬功能顯著下降(P＜0.01)，PD-1基因敲除膿毒癥小鼠可顯著增強(qiáng)枯否細(xì)胞功能(P＜0.001)。

13、　　 4、術(shù)后24 h分離肝臟枯否細(xì)胞，體外LPS繼續(xù)刺激或不刺激24 h時(shí)，野生型膿毒癥小鼠肝臟枯否細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-I0、IL-12p40和MCP-1能力顯著下降(P＜0.05)。PD-1基因敲除可部分但顯著恢復(fù)枯否細(xì)胞分泌上述細(xì)胞因子能力。
　　 5、術(shù)后24 h分離肝臟枯否細(xì)胞，體外LPS繼續(xù)刺激24 h時(shí)，野生型膿毒癥小鼠肝臟枯否細(xì)胞cleaved caspase-3水平顯著升高(P＜0

14、.001)，PD-1基因敲除可顯著減少枯否細(xì)胞cleaved caspase-3水平(P＜0.001)。
　　 6、術(shù)后24 h分離肝臟枯否細(xì)胞，體外LPS繼續(xù)刺激24 h時(shí)，野生型膿毒癥小鼠肝臟枯否細(xì)胞TUNEL染色陽性比例顯著升高，PD-1基因敲除可顯著減少枯否細(xì)胞TUNEL染色陽性比例。
　　 7、術(shù)后24 h分離肝臟枯否細(xì)胞，體外LPS繼續(xù)刺激10 min時(shí)，野生型膿毒癥小鼠肝臟枯否細(xì)胞磷酸化Akt/總Akt比例

15、顯著降低(P＜0.001)，PD-1基因敲除可顯著增加枯否細(xì)胞磷酸化Akt/總Akt比例（P＜0.001）。
　　 8、術(shù)后24 h分離肝臟枯否細(xì)胞，體外LPS繼續(xù)刺激10 min時(shí)，野生型膿毒癥小鼠肝臟枯否細(xì)胞磷酸化p38/總p38比例顯著升高(P＜0.001)，PD-1基因敲除可顯著減少枯否細(xì)胞磷酸化p38/總p38比例(P＜0.001)。
　　 9、術(shù)后24 h時(shí)，野生型膿毒癥小鼠心臟、肝臟和腎臟磷酸化Akt/總A

16、kt比例顯著降低，PD-1基因敲除可顯著增加肝臟和腎臟磷酸化Akt/總Akt比例，但心臟磷酸化Akt/總Akt比例無顯著變化。野生型膿毒癥小鼠心臟、肝臟和腎臟磷酸化STAT3/總STAT3比例顯著升高，PD-1基因敲除可顯著減少心臟和腎臟磷酸化STAT3/總STAT3比例，但是肝臟STAT3/總STAT3比例無顯著變化。
　　 [結(jié)論]
　　 PD-1參與了膿毒癥導(dǎo)致的肝臟枯否細(xì)胞功能障礙，可能通過影響枯否細(xì)胞Akt磷酸