苦柯胺B對(duì)膿毒癥時(shí)肝臟功能的保護(hù)作用及其機(jī)制.pdf

1、背景與目的:
　　脂多糖(LPS)是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的組成成分，作為外源性刺激因子可以觸發(fā)細(xì)胞因子、NO等的合成、釋放。嚴(yán)重的細(xì)菌感染可導(dǎo)致膿毒癥的發(fā)生，并且膿毒癥一旦觸發(fā)可導(dǎo)致高死亡率，這與目前膿毒癥的救治效果不佳密切相關(guān)。苦柯胺B(KB)是從中藥地骨皮中提取出來(lái)的一種與LPS和CpG DNA具高親和力的復(fù)合物。前期研究證實(shí)KB在LPS刺激的巨噬細(xì)胞及熱滅活大腸桿菌誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠中均表現(xiàn)出很好的抗炎作用。而對(duì)LPS刺激的小鼠及

2、中性粒細(xì)胞，KB的抗LPS作用尚無(wú)報(bào)道。本研究即采用LPS刺激的中性粒細(xì)胞體外模型及LPS腹腔注射誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠體內(nèi)模型，系統(tǒng)研究了KB中和LPS的能力。
　　方法:
　　In vitro，運(yùn)用LPS(1μg/mL)刺激的中性粒細(xì)胞為炎癥模型，0.1-1μM KB進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)流式檢測(cè)H2O2的水平，瓊脂糖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，western blot檢測(cè)P-p38的表達(dá)水平，評(píng)價(jià)KB對(duì)LPS刺激的中性粒細(xì)胞功能的影響;i

3、n vivo，ICR小鼠腹腔注射LPS（20mg/kg）建立小鼠膿毒癥模型，LPS注射4小時(shí)后尾靜脈給予KB(20μg/kg)或是生理鹽水。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組，LPS組及LPS+KB組。各組均于LPS注射8小時(shí)后收集小鼠血液及肝臟組織。運(yùn)用動(dòng)態(tài)濁度法檢測(cè)血漿中LPS的濃度，全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清中AST、ALT的水平，ELISA法檢測(cè)血漿及肝臟組織中細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1β）水平，分光光度計(jì)檢測(cè)肝臟組織中MPO（髓過(guò)氧化物酶）的活性，

4、免疫組化的方法檢測(cè)肝組織中ICAM-1及VCAM-1的表達(dá)情況，評(píng)價(jià)KB對(duì)膿毒癥時(shí)肝臟炎癥反應(yīng)的抑制作用;使用酶標(biāo)儀對(duì)肝臟組織中的NO（一氧化氮）、MDA（丙二醛）及SOD（超氧化物歧化酶）進(jìn)行檢測(cè)，逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)iNOS mRNA的表達(dá)水平，評(píng)價(jià)KB對(duì)膿毒癥時(shí)肝臟氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用;運(yùn)用EMSA及Western blot方法對(duì)NF-κB的活化、表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)KB對(duì)膿毒癥時(shí)NF-κB表達(dá)、活化的影響。
　　

5、結(jié)果和結(jié)論:
　　1.KB可以下調(diào)LPS刺激的中性粒細(xì)胞p38的磷酸化水平，調(diào)控其ROS產(chǎn)生、趨化水平，初步證實(shí)了KB對(duì)LPS的體外中和作用。
　　2.KB能夠顯著降低LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠血漿中LPS的含量，降低血清中AST、ALT的水平、減輕肝臟的病理改變，降低血漿及組織中細(xì)胞因子(TNF-α，IL-1β)的水平，抑制白細(xì)胞的浸潤(rùn)(MPO，ICAM-1，VCAM-1)，改善肝臟的功能，抑制肝臟炎癥反應(yīng);
　　3.K

6、B顯著抑制LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠氧化應(yīng)激產(chǎn)物NO、MDA的產(chǎn)生，維護(hù)肝臟細(xì)胞膜的完整性，減輕氧化應(yīng)激對(duì)炎癥反應(yīng)的促進(jìn)作用，此外抗氧化酶(SOD)的增高，則可改善ROS（活性氧族）的過(guò)量產(chǎn)生，平衡ROS與抗氧化物間的不平衡。
　　4.KB可以顯著減輕NF-κB p65的表達(dá)及NF-κB的活化，抑制因NF-κB活化、表達(dá)所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激產(chǎn)物增多。
　　綜上所述，本實(shí)驗(yàn)采用LPS刺激的中性粒細(xì)胞為體外模型，LPS腹腔注射