苦柯胺B對膿毒癥時肝臟功能的保護作用及其機制.pdf

1、背景與目的:
　　脂多糖(LPS)是革蘭陰性菌細胞壁的組成成分，作為外源性刺激因子可以觸發(fā)細胞因子、NO等的合成、釋放。嚴(yán)重的細菌感染可導(dǎo)致膿毒癥的發(fā)生，并且膿毒癥一旦觸發(fā)可導(dǎo)致高死亡率，這與目前膿毒癥的救治效果不佳密切相關(guān)?？嗫掳稡(KB)是從中藥地骨皮中提取出來的一種與LPS和CpG DNA具高親和力的復(fù)合物。前期研究證實KB在LPS刺激的巨噬細胞及熱滅活大腸桿菌誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠中均表現(xiàn)出很好的抗炎作用。而對LPS刺激的小鼠及

2、中性粒細胞，KB的抗LPS作用尚無報道。本研究即采用LPS刺激的中性粒細胞體外模型及LPS腹腔注射誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠體內(nèi)模型，系統(tǒng)研究了KB中和LPS的能力。
　　方法:
　　In vitro，運用LPS(1μg/mL)刺激的中性粒細胞為炎癥模型，0.1-1μM KB進行干預(yù)，通過流式檢測H2O2的水平，瓊脂糖實驗檢測細胞遷移能力，western blot檢測P-p38的表達水平，評價KB對LPS刺激的中性粒細胞功能的影響;i

3、n vivo，ICR小鼠腹腔注射LPS（20mg/kg）建立小鼠膿毒癥模型，LPS注射4小時后尾靜脈給予KB(20μg/kg)或是生理鹽水。實驗分為對照組，LPS組及LPS+KB組。各組均于LPS注射8小時后收集小鼠血液及肝臟組織。運用動態(tài)濁度法檢測血漿中LPS的濃度，全自動生化儀檢測血清中AST、ALT的水平，ELISA法檢測血漿及肝臟組織中細胞因子（TNF-α、IL-1β）水平，分光光度計檢測肝臟組織中MPO（髓過氧化物酶）的活性，

4、免疫組化的方法檢測肝組織中ICAM-1及VCAM-1的表達情況，評價KB對膿毒癥時肝臟炎癥反應(yīng)的抑制作用;使用酶標(biāo)儀對肝臟組織中的NO（一氧化氮）、MDA（丙二醛）及SOD（超氧化物歧化酶）進行檢測，逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR法檢測iNOS mRNA的表達水平，評價KB對膿毒癥時肝臟氧化應(yīng)激損傷的保護作用;運用EMSA及Western blot方法對NF-κB的活化、表達進行檢測，評價KB對膿毒癥時NF-κB表達、活化的影響。
　　

5、結(jié)果和結(jié)論:
　　1.KB可以下調(diào)LPS刺激的中性粒細胞p38的磷酸化水平，調(diào)控其ROS產(chǎn)生、趨化水平，初步證實了KB對LPS的體外中和作用。
　　2.KB能夠顯著降低LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠血漿中LPS的含量，降低血清中AST、ALT的水平、減輕肝臟的病理改變，降低血漿及組織中細胞因子(TNF-α，IL-1β)的水平，抑制白細胞的浸潤(MPO，ICAM-1，VCAM-1)，改善肝臟的功能，抑制肝臟炎癥反應(yīng);
　　3.K

6、B顯著抑制LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠氧化應(yīng)激產(chǎn)物NO、MDA的產(chǎn)生，維護肝臟細胞膜的完整性，減輕氧化應(yīng)激對炎癥反應(yīng)的促進作用，此外抗氧化酶(SOD)的增高，則可改善ROS（活性氧族）的過量產(chǎn)生，平衡ROS與抗氧化物間的不平衡。
　　4.KB可以顯著減輕NF-κB p65的表達及NF-κB的活化，抑制因NF-κB活化、表達所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激產(chǎn)物增多。
　　綜上所述，本實驗采用LPS刺激的中性粒細胞為體外模型，LPS腹腔注射