標(biāo)準(zhǔn)化大鼠CLP膿毒癥模型的建立及甲磺酸苦柯胺B對其的保護(hù)作用與機(jī)制研究.pdf

1、1.目的
　　膿毒癥(Sepsis)是由感染因素引起的全身性炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflammatoryresponsesyndrome，SIRS)，是臨床病人發(fā)生感染后的常見并發(fā)癥，并已成為導(dǎo)致臨床危重癥患者死亡的首要因素，目前尚無有效的藥物用于臨床治療。
　　為研發(fā)有效的治療膿毒癥藥物，本實(shí)驗(yàn)室以介導(dǎo)細(xì)菌膿毒癥的主要病原體相關(guān)分子——細(xì)菌脂多糖/內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)和細(xì)菌Cp

2、GDNA為靶標(biāo)，應(yīng)用基于生物傳感器的篩選和定向分離技術(shù)，從地骨皮藥材中定向分離得到一個能同時拮抗LPS和CpGDNA的生物堿類化合物苦柯胺B。
　　由于天然提取物產(chǎn)率低，無法滿足臨床用藥需求，為此我們對該化合物進(jìn)行了全化學(xué)合成，制備獲得了該化合物的藥用鹽——甲磺酸苦柯胺B(KukoamineB，KB)。前期研究證實(shí)，該化合物能夠顯著提高膿毒癥模型小鼠的存活率，降低其血中LPS和炎癥介質(zhì)TNF-α的水平。
　　由于從小鼠模型中

3、獲取的標(biāo)本（尤其是血液樣品）不足以支持治療膿毒癥藥物深入的藥效學(xué)和作用機(jī)制的研究，因此，為滿足KB作為原創(chuàng)新藥申報(bào)國家1.1類化藥的藥效學(xué)研究的需要，本研究通過探索、改進(jìn)建模方法，建立了成熟穩(wěn)定的盲腸結(jié)扎穿孔(cecalligationandpuncture，CLP)大鼠膿毒癥模型，并應(yīng)用該模型研究了KB治療膿毒癥的藥理作用及機(jī)制，為其臨床前研究奠定基礎(chǔ)。
　　2.方法
　　2.1標(biāo)準(zhǔn)化CLP膿毒癥大鼠模型的建立及首次使用抗

4、菌藥物時間的確定
　　2.1.1穩(wěn)定的CLP膿毒癥模型術(shù)式的篩選與建立:比較自制三棱針與傳統(tǒng)穿刺針、傳統(tǒng)穿刺針+引流條、傳統(tǒng)穿刺針+引流管等不同穿刺方法建模后大鼠死亡率的穩(wěn)定性差別。
　　2.1.2不同死亡率CLP膿毒癥模型大鼠的建立:采用3、4、5號三棱針(邊徑分別為3、4和5mm)穿刺建模，觀察大鼠死亡率;確定死亡率為70％-90％CLP大鼠膿毒癥模型用于藥物保護(hù)實(shí)驗(yàn);確定死亡率為30％-50％的CLP大鼠膿毒癥模型用于

5、藥物治療實(shí)驗(yàn)。
　　2.1.3CLP膿毒癥大鼠模型首次抗菌藥物使用時間點(diǎn)的篩選:在死亡率為70％-90％的CLP大鼠膿毒癥模型中，分別于術(shù)后0、1、2、3、4、5、6、7、8h首次靜脈注射抗菌藥物(100mg/kg舒氨西林+甲硝唑5mg/kg)，觀察大鼠死亡率，確定利于藥物療效觀察的抗菌藥物首次給藥時間。
　　2.2KB對CLP膿毒癥大鼠模型的保護(hù)作用:建立死亡率為70％-90％的CLP大鼠模型，在抗菌、補(bǔ)液治療的基礎(chǔ)上，給

6、予低、中、高劑量(0.3、1和3μg/kg)的KB，選用烏司他丁(10000U/kg)作為對照藥物，觀察KB對CLP膿毒癥大鼠模型的保護(hù)作用。
　　2.3KB對CLP膿毒癥模型大鼠的治療作用:建立死亡率為30％-50％的CLP膿毒癥大鼠模型，在抗菌、補(bǔ)液治療的基礎(chǔ)上，分別給予中、高劑量(1和3μg/kg)的KB以及烏司他丁(10000U/kg)。在CLP術(shù)后4、8、12、24h采集血液標(biāo)本，檢測各時相點(diǎn)血中的細(xì)菌量、LPS和炎癥介

7、質(zhì)(TNF-α和IL-6)、血常規(guī)、凝血和血生化指標(biāo)的變化情況。在術(shù)后24h采集肺組織和小腸組織，光鏡下觀察組織病理改變，以評價(jià)KB對CLP膿毒癥模型大鼠的治療作用。
　　2.4KB改善CLP膿毒癥大鼠模型急性肺損傷的作用及其機(jī)制研究
　　2.4.1體外實(shí)驗(yàn):分離大鼠外周血嗜中性粒細(xì)胞，檢測分析KB與烏司他丁干預(yù)LPS刺激嗜中性粒細(xì)胞后，對炎癥介質(zhì)信號分子和轉(zhuǎn)錄因子活化以及炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6和彈性蛋白酶的表達(dá)的影響

8、，探討KB改善CLP膿毒癥模型大鼠急性肺損傷的機(jī)制。
　　2.4.2體內(nèi)實(shí)驗(yàn):建立死亡率為30％-50％的CLP膿毒癥大鼠模型，在抗菌、補(bǔ)液治療的基礎(chǔ)上，分別給予高劑量(3μg/kg)的KB以及烏司他丁(10000U/kg)。術(shù)后12、24h取肺組織，檢測肺干濕重，檢測肺組織中信號分子(IκB-α和p38)和轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)活化情況、炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-6和彈性蛋白酶的表達(dá)變化。
　　3.結(jié)果
　　3.1自

9、制三棱針較傳統(tǒng)穿刺針可更好地建立穩(wěn)定的CLP膿毒癥大鼠模型
　　3.1.1自制三棱針較傳統(tǒng)穿刺針建立的CLP膿毒癥大鼠模型動物組間死亡率差異小:自制三棱針穿刺建立的CLP膿毒癥大鼠模型動物組間死亡率差異不超過10％，而采用傳統(tǒng)穿刺針、穿刺針+引流條、穿刺針+引流管和錐形三棱針的方法建立的CLP膿毒癥大鼠模型動物的組間死亡率差異可高達(dá)50％、60％、50％和40％。說明采用自制三棱針較傳統(tǒng)穿刺針可更好地建立穩(wěn)定的CLP膿毒癥大鼠模型

10、。
　　3.1.2自制三棱針的邊徑與模型動物的死亡率成正相關(guān):3＃針組為20％-30％，4#針組為30％-50％，5#針組為70％-90％。
　　建立死亡率為70％-90％的大鼠CLP膿毒癥模型主要條件為:盲腸結(jié)扎1.6cm，用5號三棱針穿刺1孔;建立死亡率為30％-50％的大鼠CLP膿毒癥模型主要條件為:盲腸結(jié)扎1.6cm，用4號三棱針穿刺1孔。
　　3.1.3在CLP膿毒癥模型大鼠中確定首次使用抗菌藥物的時間為術(shù)后

11、7h:在死亡率為70％-90％的CLP膿毒癥模型大鼠中，抗菌藥物首次使用時間為術(shù)后5h以內(nèi)，可顯著提高大鼠存活率(P＜0.05或0.01)，當(dāng)抗菌藥物首次使用時間為術(shù)后6h-8h，單獨(dú)抗菌已不能提高大鼠的存活率(P＞0.05)，可模擬臨床抗菌藥物無效的情況，有利于目標(biāo)藥物藥理作用的觀察，因此本研究中將抗菌藥物首次使用時間確定為術(shù)后7h。
　　3.2KB可顯著提高CLP膿毒癥模型大鼠的生存率
　　生理鹽水(NS)組大鼠7天生存

12、率為13.33％，抗菌藥物組為36.67％，二者無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　對照藥物烏司他丁組大鼠生存率為63.33％，與抗菌藥物組比較具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。
　　低、中、高劑量的KB(0.3、1和3μg/kg)組可顯著提高大鼠生存率，由36.67％提高至63.33％、70.00％和86.67％，具有顯著和非常顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05或0.01vs抗菌藥物組)。KB低劑量組的大鼠生存率與烏司他丁

13、組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05），而中高劑量組保護(hù)作用優(yōu)于烏司他丁(P＜0.05）。
　　3.3KB對CLP膿毒癥大鼠模型具有顯著的治療作用
　　相對于假手術(shù)組，NS組大鼠血中可檢出細(xì)菌，血LPS和炎癥介質(zhì)TNF-α和IL-6水平顯著升高，并出現(xiàn)了動脈血pH下降、凝血功能異常(APTT↑、PT↑、PLT↓)、肝、腎功能異常(ALT、AST、TBIL、Cr和BUN↑)和心肌損傷(CK-MB↑)，病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)肺組織出現(xiàn)出血、水腫

14、等改變，小腸組織出現(xiàn)上皮細(xì)胞壞死、脫落、嗜中性粒細(xì)胞的浸潤為主要特征的急性炎癥性損傷。
　　抗菌藥物可有效降低大鼠血細(xì)菌計(jì)數(shù)外，但不能改善其他觀察指標(biāo)。但在抗菌、補(bǔ)液治療的基礎(chǔ)上給予KB，可顯著降低CLP模型大鼠血中LPS水平、抑制炎癥介質(zhì)TNF-α和IL-6的釋放，還可有效減輕大鼠的凝血功能障礙、抑制動脈血pH值降低，并減輕腎臟和心肌功能異常，減輕肺和小腸組織炎癥性損傷等癥狀，效果優(yōu)于對照藥物烏司他丁。
　　3.4KB可減

15、輕CLP膿毒癥大鼠模型的急性肺損傷，其機(jī)制與抑制炎癥介質(zhì)密切相關(guān)。
　　體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，KB可抑制LPS誘導(dǎo)的嗜中性粒細(xì)胞胞TNF-α、IL-6、彈性蛋白酶和TLR4等炎癥介質(zhì)和受體的表達(dá)，抑制LPS誘導(dǎo)的胞內(nèi)重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子p38、IκB-α活化和轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，KB能顯著降低CLP模型大鼠肺干濕重比值，抑制肺組織信號分子p38和IκB-α的活化以及TNF-α、IL-6和彈性蛋白酶的升高。對照藥物烏司

16、他丁對大鼠肺損傷也具有一定的減輕作用，但KB的作用強(qiáng)于烏司他丁。
　　4.結(jié)論:
　　4.1成功建立了穩(wěn)定的CLP膿毒癥大鼠模型
　　自制三棱針較傳統(tǒng)穿刺針可更好地建立穩(wěn)定的CLP膿毒癥大鼠模型，解決了傳統(tǒng)CLP膿毒癥模型大鼠中由于穿刺引流入腹腔中的菌量不易控制而造成的CLP膿毒癥模型重復(fù)性差的難題。本方法操作簡單、可控，模型大鼠的死亡率穩(wěn)定、重現(xiàn)性好，可用于后續(xù)的藥物研究。
　　4.2KB可顯著提高CLP膿毒癥