SCF-KIT途徑在單頻準分子光治療白癜風中的作用研究.pdf

1、第一部分：白癜風患者皮損區(qū)SCF和KlT蛋白的表達 目的：探討SCF/KIT途徑在白癜風發(fā)病中的作用。 方法：采用免疫組化法檢測12 例三色白癜風患者正常皮膚、淺白色色素減退區(qū)和純白色色素脫失區(qū)表皮角質(zhì)形成細胞干細胞因子和基底層黑素細胞KIT蛋白的表達情況；采用ELISA法檢測穩(wěn)定期白癜風患者皮損處與正常皮膚可溶型SCF的表達并分析表皮移植后色素恢復程度與可溶型 SCF。表達的關系。 結(jié)果：與正常膚色皮膚相比，淺

2、白色色素減退區(qū)和純白色色素脫失區(qū)表皮SCF的表達均增加，且純白色色素脫失區(qū)表達更明顯；與SCt表達相反，KIT蛋白在淺白色色素減退區(qū)表達與膚色正常皮膚相比明顯減少(P<0.05)，純白色色素脫失區(qū)KIT蛋白表達完全缺失。穩(wěn)定期白癜風患者皮損區(qū)皰液中可溶型SCF平均濃度為920.43±398.23pg/ml，明顯高于正常皮膚皰液中可溶型SCF的濃度：716.87±135.84 pg/ml，二者相比具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。并且可溶型

3、SCF的表達與表皮移植后色素的恢復程度具有一定關聯(lián)。 結(jié)論：SCF.KIT的異常表達可能參與了白癜風的發(fā)病過程；可溶型SCF可能在白癜風皮損的恢復中發(fā)揮重要作用。 第二部分308nm單頻準分子光對人角質(zhì)形成細胞的凋亡,細胞周期和SCF表達的影響 目的：探討308nm單頻準分子光對人角質(zhì)形成細胞的凋亡，細胞周期和SCF表達的影響。 方法：采用MTT法確定最適能量密度，用Annexin V在流式細胞儀上檢測3

4、08nm單頻準分子光對角質(zhì)形成細胞早期凋亡的影響，采用PI在流式細胞儀上檢測角質(zhì)形成細胞細胞周期改變；RT-PCR 和 Western-blotting及ELISA分別檢測308nm單頻準分子光對角質(zhì)形成細胞SCF基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平的影響。 結(jié)果：用400mJ/cm<'2>308nm單頻準分子光照射角質(zhì)形成細胞后24和48小時，細胞凋亡明顯增加(P<0.05)，48小時時S期細胞雖有增加，但無統(tǒng)計學意義(P=0.059)；S

5、CFmRNA和蛋白表達均增加，在照射后12小時左右達高峰；且蛋白表達隨著照射劑量的增加而增加，但mRNA的表達未隨劑量的增加而改變。 結(jié)論：308nm單頻準分子光可導致角質(zhì)形成細胞凋亡，但促進SCF的表達，這可能是準分子光治療白癜風的機制之一。 第三部分308nm單頻準分子光對人黑素細胞凋亡、周期和KIT蛋白表達的影響 目的：探討308nm單頻準分子光對體外培養(yǎng)的人黑素細胞細胞凋亡、細胞周期和KIT蛋白表達的影響

6、。 方法：用MTT法分別檢測低劑量和高劑量308nm單頻準分子光照射后24小時對黑素細胞存活率的影響；用Annexin V在流式細胞儀上檢測低劑量照射后24小時和400mJ/cm<'2>劑量照射后不同時間黑素細胞早期凋亡的情況；采用PI在流式細胞儀上檢測80mJ/cm<'2>和400mJ/cm<'2>劑量照射后24小時和48小時細胞周期的變化；采用實時熒光PCR和werstem-blot分別檢測低劑量308nm單頻準分子光照射后

7、24小時和400mJ/cm<'2>劑量照射后0、0．5、1、2、4小時時黑素細胞c-kit mRNA和KIT蛋白的表達。 結(jié)果：低劑量308nm單頻準分子光照射后24小時，黑素細胞存活率出現(xiàn)先增加后減少的趨勢，但與對照相比無統(tǒng)計學意義，高劑量照射后出現(xiàn)存活率逐漸下降，至600mJ/cm<'2>劑量時細胞存活率只有74.15±19.82％，與陰性對照相比具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。早期凋亡的檢測結(jié)果顯示：低劑量照射后24小時，

8、黑素細胞早期凋亡呈現(xiàn)逐漸減少的趨勢，80 mJ/cm<'2>劑量時最低為9.56±1.16％，但與對照相比無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，隨著照射劑量的增加，細胞凋亡率開始增加，300 mJ/cm<'2>劑量時的凋亡率為14.07±1.11％，與對照相比具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；400 mJ/cm<'2>劑量照射后0、6、12、24小時，黑素細胞凋亡率逐漸增加，24小時時達21.19±2.06％，與對照相比具有明顯統(tǒng)計學意義(P<0

9、.05)。80mJ/cm<'2>劑量照射黑素細胞后24小時，S 期細胞明顯高于其對照，分別為 29.06±0.759％和22.64±0.07％；照射后48 小時，S 期細胞有所下降，但光照組 S 期細胞仍高于對照組，分別為12.28±0.82％和8.42±0.17％，統(tǒng)計學檢驗差別具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。400mJ/cm<'2>劑量照射后照射組和對照組S期細胞24小時時分別為：15.64±1.05％和31.66±1.68％；48

10、小時時分別為15.07±2.21％和23.76±0.41％。兩者間差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。低劑量308nm單頻準分子光照射后24小時，c-kit mRNA表達呈先增加后減少的趨勢，80mJ/cm<'2>劑量時達高峰，KIT蛋白的表達與mRNA的表達趨勢一致；400mJ/cm<'2>劑量照射后4小時內(nèi)，c-kit mRNA 和蛋白的表達均出現(xiàn)迅速下降，與對照相比有明顯統(tǒng)計學意義(P<0.05)。 結(jié)論：低劑量308nm

11、單頻準分子光促進黑素細胞增殖和KIT蛋白的表達，這可能是其治療白癜風的機制之一；高劑量308nm單頻準分子光抑制黑素細胞增殖和KIT蛋白的表達，這一機制可能參與了暴曬后誘發(fā)白癜風的過程。 第四部分角質(zhì)形成細胞與黑素細胞共培養(yǎng)及可溶性SCF對黑素細胞增殖、黑素合成和KIT蛋白表達的影響 目的：探討可溶型SCF對黑素細胞增殖、黑素合成和KIT蛋白表達的影響。 方法：將黑素細胞和角質(zhì)形成細胞共培養(yǎng)作為對照，向純培養(yǎng)的黑

12、素細胞內(nèi)加入人工重組的可溶型SCF，采用實時熒光PCR和Western-blot分別檢測4小時和24小時時KIT受體mINA和蛋白的表達；用NaoH法檢測72小時后黑素細胞黑素合成量，用鏡下記數(shù)法檢測黑素細胞增殖情況。 結(jié)果：黑素細胞與角質(zhì)形成細胞共培養(yǎng)及加入可溶型SCF后4小時和24小時，黑素細胞c-kit mRNA均無明顯改變，但 4 小時時，黑素細胞KIT蛋白表達出現(xiàn)減少，24小時時又出現(xiàn)輕度增高；72小時后，加入可溶型S