潰結靈對潰瘍性結腸炎模型大鼠Toll樣受體及NF-κB的作用.pdf

1、免疫因素尤其是細胞因子在IBD的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，對這些細胞因子的研究使UC的發(fā)病及治療研究有了一定的進展，治療上取得了一定的效果，但尚未能認識UC發(fā)病的關鍵環(huán)節(jié)。隨著對細胞因子、粘附分子的研究，尤其近年對核因子-κB(NF-κB)及Toll樣受體(TLRs)的研究，正逐步揭示著IBD的發(fā)病機制，TLRs/NF-κB通路的部分闡明也為尋找IBD的治療提供了新的契機，通過抑制此通路的關鍵分子進而阻斷IBD過激的炎癥反應已成為眾多學者研

2、究的方向。中醫(yī)藥在UC的治療上有較好的療效，很多達到與西藥相近的治療效果，且可彌補西藥較大毒副作用及停藥后易復發(fā)的不足，有著廣闊的應用和開發(fā)前景。中醫(yī)藥治療IBD的實驗研究尤其是作用機理的研究是目前中醫(yī)藥治療IBD尤其是UC的重點，在這方面的研究取得進展，將會揭示中藥作用的較確切的作用靶點。本研究對治療UC療效確切的中藥復方潰結靈進行深入的作用機理研究，在前期臨床、實驗研究基礎上更進一步從細胞因子表達的源頭TLRs/NF-κB通路入手，

3、觀察潰結靈對此通路的一些關鍵環(huán)節(jié)TLR2、TLR4表達和NF-κB活化的干預作用，這一研究將使中醫(yī)藥治療UC的機理研究深入到基因調控水平，并為高質量的抗UC中藥新藥的開發(fā)打下堅實的基礎。 1潰結靈對UC大鼠治療作用的病理觀察 我們研究所在多年臨床經驗的基礎上，以清熱健脾活血為治則，總結出治療潰瘍性結腸炎的中藥復方潰結靈，臨床取得了較好的療效，無明顯毒副作用。為驗證其臨床療效，并進一步探討其作用機理，我們采用三硝基苯磺酸法

4、制作潰瘍性結腸炎大鼠模型，并在此模型上觀察了潰結靈的治療效果，潰結靈采用三個劑量給藥治療，陽性組用SASP治療，并設陰性(模型空白)及正常對照組。治療結束進行病理觀察，大體觀察計數潰瘍個數、測量潰瘍總面積、并計算組織損傷積分，光鏡下觀察腸粘膜組織炎癥、水腫和充血程度(分級法)。結果表明，模型組腸粘膜出現大小不等的潰瘍，光鏡下顯示炎癥和水腫程度較重；大體觀察潰結靈高、中劑量組潰瘍個數、潰瘍面積、組織損傷積分均明顯少于模型組(P＜0.05或

5、P＜0.01)；光鏡下觀察潰結靈高、中劑量組腸粘膜炎癥程度明顯輕于模型組(P＜0.05或P＜0.01)；潰結靈高劑量組腸粘膜充血和水腫程度較模型組明顯減輕(P＜0.05)。潰結靈能明顯減少模型大鼠結腸潰瘍個數和面積，改善結腸粘膜炎癥和水腫等病理變化，提示潰結靈對三硝基苯磺酸潰瘍性結腸炎大鼠模型有較好的治療作用，驗證了臨床治療效果。 2潰結靈對UC大鼠血清中促炎因子IL-1β、TNF-α的作用 細胞因子在潰瘍性結腸炎的發(fā)病

6、及進展中起到了重要的作用，尤其是促炎因子，其中IL-1β和TNF-α最具代表性。我們在潰結靈抗實驗性UC作用的基礎上，觀察了該藥對IL-1β、TNF-α的作用，不僅是對該藥療效的進一步驗證，也是對其作用機制的探討。采用三個劑量對TBNS法UC大鼠模型進行治療，治療結束采血并制備血清樣本，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測血清樣本中IL-1β、TNF-α的含量。結果表明，潰結靈高、中劑量組血清樣本中TNF-α、IL-1β的含量明顯小于

7、模型組血清樣本(P＜0.01)。提示潰結靈能夠降低模型大鼠血中對UC發(fā)病及進展起重要作用的促炎因子IL-1β、TNF-α的含量。 3潰結靈對UC大鼠血清中抑炎因子IL-4的作用 在潰瘍性結腸炎發(fā)病的免疫學機制中，促炎因子和抑炎因子的失衡是潰瘍性結腸炎發(fā)生發(fā)展的重要因素。為探討潰結靈治療UC的作用機理，我們在潰結靈抗實驗性UC作用的基礎上，觀察了該藥對抑炎因子IL-4的作用。采用三個劑量對TBNS法UC大鼠模型進行治療，治

8、療結束采血并制備血清樣本，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測血清樣本中IL-4的含量，并進行統計學分析。結果表明，模型組血清樣本中IL-4的含量明顯高于正常對照組(P＜0.01)；潰結靈高劑量組IL-4含量明顯小于模型組(P＜0.01)。IL-4在潰瘍性結腸炎患者和實驗動物模型中的含量變化目前存在較大爭議，甚至有相對立的結果出現，本實驗潰結靈降低IL-4的含量在其抗UC療效中的作用尚有待進一步研究。 4潰結靈對UC大鼠結腸粘

9、膜NF-κBP65蛋白表達的作用 近年對核因子-κB(NF-κB)及Toll樣受體(TLRs)/NF-κB通路的研究，正逐步揭示著IBD的發(fā)病機制，成為當前潰瘍性結腸炎發(fā)病及治療研究的熱點。我們在前面研究工作的基礎上，對結腸粘膜NF-κBP65蛋白表達進行檢測，以期對潰結靈治療UC的較深層次的作用機理進行探討。采用三個劑量對TBNS法UC大鼠模型進行治療，治療結束后取結腸組織固定，切片進行免疫組化染色，光鏡下計數陽性細胞百分率，

10、并進行統計學分析。結果表明，模型組結腸粘膜P65蛋白陽性細胞表達率明顯高于正常對照組(P＜0.01)；潰結靈高、中劑量組結腸粘膜P65蛋白陽性細胞表達率明顯低于模型組(P＜0.01)。提示潰結靈能明顯降低UC大鼠模型結腸粘膜NF-κP65蛋白陽性細胞率。 5潰結靈對UC大鼠結腸粘膜Toll樣受體2、4基因表達的作用 Toll樣受體(TLRs)是NF-κB激活的TLRs/NF-κB通路的重要環(huán)節(jié)。通過對TOLL樣受體表達的

11、抑制，可以抑制TLRs/NF-κB通路的活化，從而對潰瘍性結腸炎起到治療作用，因此我們觀察了潰結靈對TBNS法UC大鼠模型結腸組織中TLR2、TLR4表達的作用，以期對潰結靈治療UC的作用機制進行較深入的探討。采用三個劑量對TBNS法UC大鼠模型進行治療，治療結束后采集結腸粘膜標本。用Trizol提取總RNA進行逆轉錄反應，以β-actin作為內參進行PCR反應，產物進行凝膠電泳分離，經染色后進行灰度分析，以TLR2、TLR4的灰度值與

12、β-actin灰度值的比值作為相對表達量，進行組間比較分析。結果表明，模型組TLR2、TLR4基因相對表達量明顯高于正常組(P＜0.01)；潰結靈中、高劑量組TLR2相對表達量明顯低于模型組(P＜0.05)；潰結靈高劑量組TLR4相對表達量明顯低于模型組(P＜0.05)。潰結靈對TNBS法UC大鼠模型結腸粘膜TLR2、TLR4基因表達有抑制作用。 TLRs/NF-κB通路在IBD的發(fā)生發(fā)展中占舉足輕重的地位，NF-κB對很多UC

13、發(fā)病的關鍵性細胞因子有調控作用，從而參與了UC腸道的炎癥和免疫反應。當上游刺激因子與TLRs結合，TLRs向細胞內傳遞活化信號，激活NF-κB等轉錄因子，進而調節(jié)炎癥遞質的產量，導致IBD炎癥粘膜的損傷。NF-κB活化后會產生持續(xù)擴大的炎癥反應，使病情不斷進展，這時即使初始病因得以去除，炎癥反應也不會立即終止。對TLRs/NF-κB通路中的關鍵環(huán)節(jié)NF-κB、TLRs及其上(下)游分子如TNF-α、IL-1β等進行干預，可以有效地阻止U