潰腸寧對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸粘膜TLR2、NF-κB、IKK-β及IL-13等細(xì)胞因子影響的研究.pdf

1、研究目的:通過運用三硝基苯磺酸灌腸，建立大鼠潰瘍性結(jié)腸炎動物模型，研究中藥方劑潰腸寧對潰瘍性結(jié)腸炎模型大鼠結(jié)腸粘膜TLR2、NF-κB、IKK-β和細(xì)胞因子IL-13、TNF-α和IL-1β等的影響，探尋潰腸寧治療潰瘍性結(jié)腸炎的機理機制，可為其更深入的藥理及相應(yīng)的臨床研究奠定下確切的實驗方面的基礎(chǔ)。
　　研究方法:
　　階段一：實驗大鼠分組：SPF級成年Wistar大鼠40只，雌雄各半，體重（170-200）g，隨機分配成4

2、組，分別為空白對照組、模型組、中藥組（潰腸寧組）、西藥組（柳氮磺胺吡啶組），各組10只。
　　階段二：潰瘍性結(jié)腸炎的大鼠模型建立及給藥：采用TNBS復(fù)合50％乙醇法造模。除空白對照組，其他各組用戊巴比妥鈉麻醉大鼠后,將鈍頭導(dǎo)管從肛門插至距肛門8cm處,按80mg/kg三硝基苯磺酸（TNBS）復(fù)合50%的乙醇量緩慢灌腸,誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎.15天后再次給予30 mg/kg TNBS溶液灌腸,造成復(fù)發(fā)性結(jié)腸炎。于第二次造模日，即第一次造模

3、后16天開始灌胃給藥，正常組和模型組分別給予0.9%的生理鹽水1ml/100g灌胃,中藥組給予中藥方潰腸寧1ml/100g(1.35g/ml)灌胃，西藥組給予柳氮磺胺吡啶1ml/100g(0.03g/ml)灌胃。以上各組每日灌胃1次，連續(xù)7天。
　　階段三：指標(biāo)檢測：大鼠禁食24h,0.3%戊巴比妥鈉腹腔方式注射以麻醉大鼠，剖取全結(jié)腸以冰冷鹽水清洗完全,先以肉眼觀察大鼠結(jié)腸黏膜之充血、腫脹、潰瘍或穿孔流血等的病變情況，取1cm左右

4、結(jié)腸組織于4%多聚甲酸固定,脫水后石蠟包埋切片,常規(guī)HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸形態(tài)及組織學(xué)變化,剩下結(jié)腸組織運用免疫組化法(IHC-P)檢測NF-κB及Toll樣受體2的蛋白表達(dá)水平量，另外用Real-time PCR檢測IKK-β的基因表達(dá)變化，用酶聯(lián)反應(yīng)吸附試驗（ELISA法）檢測大鼠結(jié)腸中腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)、白介素-13(IL-13)的表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果:
　　1.大鼠一般

5、情況
　　空白對照組大鼠精神佳，毛發(fā)濃密白亮有光澤，飲食狀況佳、活動正常，大便成形，無膿血便和粘液便，體重明顯增加。余三組于第二次造模出現(xiàn)大便不成形，伴有粘液或膿血便，毛發(fā)不同程度的失去光澤，反應(yīng)遲鈍，精神萎靡，活動減少，體重減輕。經(jīng)治療后，潰腸寧方組與模型組相比較：大鼠的一般情況明顯好轉(zhuǎn)，體重增加，活動靈敏，食欲好轉(zhuǎn)，大便成形，無粘液及膿血。
　　2.大鼠結(jié)腸中TLR2的含量
　　與空白對照組比較，模型組大鼠TLR2

6、表達(dá)顯著增高，具有非常顯著性差異;與模型組相比較，潰腸寧方組可降低大鼠結(jié)腸TLR2的含量，有明顯顯著性差異;與柳氮磺胺吡啶組比較，潰腸寧方組大鼠結(jié)腸粘膜TLR2含量與之無明顯差異。
　　3.大鼠結(jié)腸中NF-κB的含量
　　與空白對照組比較，模型組大鼠核因子-κB表達(dá)顯著增高，具有較明顯的差異;與模型組相比，潰腸寧方組可明顯降低大鼠結(jié)腸NF-κB的含量，有十分顯著性差異;與柳氮磺胺吡啶組比較，潰腸寧方組大鼠結(jié)腸粘膜NF-κB與

7、之無明顯差異。
　　4.大鼠結(jié)腸中IKK-β的表達(dá)量
　　與空白對照組比較，模型組大鼠結(jié)腸中IKK-β表達(dá)顯著增高，具有非常顯著性差異;與模型組相比較，潰腸寧方組可降低大鼠結(jié)腸IKK-β的含量，有顯著性差異;潰腸寧方組與西藥治療組比較無顯著性差異。
　　5. TNF-α在大鼠結(jié)腸中的表達(dá)變化
　　與空白對照組比較，模型組大鼠結(jié)腸中TNF-α表達(dá)顯著增高，具有明顯顯著性差異;與模型組相比較，潰腸寧方組可降低大鼠結(jié)腸

8、TNF-α的含量，有顯著性差異;潰腸寧方組大鼠結(jié)腸粘膜TNF-α含量與西藥組比較降低，具有顯著差異。
　　6.IL-13在大鼠結(jié)腸中的表達(dá)變化
　　與空白對照組比較，模型組大鼠結(jié)腸中IL-13表達(dá)顯著降低，具有明顯顯著性差異;與模型組相比較，潰腸寧方組可顯著增加大鼠結(jié)腸中IL-13的含量，有顯著性差異;潰腸寧方組與西藥組比較，大鼠結(jié)腸粘膜中IL-13含量顯著增加，具有顯著差異。
　　7. IL-1β在大鼠結(jié)腸中的表達(dá)變

9、化
　　與空白對照組比較大鼠結(jié)腸粘膜中IL-1β表達(dá)，模型組顯著增高，具有相當(dāng)顯著的差異;與模型組相比較，潰腸寧方組可降低大鼠結(jié)腸IL-1β的含量，有顯著性差異;潰腸寧方組大鼠結(jié)腸粘膜中IL-1β含量比西藥組顯著性降低，具有明顯的差異。
　　結(jié)論:
　　1.潰腸寧方對潰潰瘍性結(jié)腸炎的療效確切，本課題UC模型建立成功，潰腸寧方可抑制UC的炎性浸潤，并促進(jìn)結(jié)腸粘膜的修復(fù)，起到治療UC的作用。
　　2.潰腸寧方可降低U

10、C大鼠結(jié)腸粘膜中TLR2的表達(dá)水平，調(diào)節(jié)腸道炎癥介質(zhì)的產(chǎn)量及免疫反應(yīng)，減輕UC大鼠結(jié)腸粘膜的損傷程度，TLR-2可能是潰腸寧方治療UC大鼠過程中較重要的靶位。
　　3.潰腸寧方可抑制UC大鼠模型中過度激活的NF-κB，NF-κB的表達(dá)水平在一定程度上可反應(yīng)UC的粘膜損害程度。潰腸寧方可有效下調(diào)NF-κB的表達(dá)水平，并可減輕其結(jié)腸粘膜的炎癥反應(yīng)，這可能為本方治療UC大鼠的機理之一。
　　4.潰腸寧方可下調(diào)UC大鼠結(jié)腸粘膜中IK