破骨細(xì)胞完善體外類骨組織重建的探索性研究.pdf

1、近來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)明確表明了破骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用對(duì)于正常的骨形成是至關(guān)重要的。破骨細(xì)胞缺乏動(dòng)物所表現(xiàn)出來(lái)的骨形成異常在目前的組織工程化骨中也都有所反映。因此，破骨細(xì)胞參與到骨體外重建策略中來(lái)不僅能洞察移植后骨重塑以及成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞相互作用，而且也能為完善組織工程化骨提供必要的解決辦法。本研究主要探索既符合生理過(guò)程又實(shí)際有效的破骨細(xì)胞引入途徑。 目的：1)獲取破骨細(xì)胞前體(融合前破骨細(xì)胞，pOCs)并描述其生物學(xué)特征；2)實(shí)驗(yàn)

2、分析成骨細(xì)胞的分化程度與pOCs成熟的關(guān)系；3)建立創(chuàng)新的破骨細(xì)胞在組織工程化骨生成方法；4)觀察破骨細(xì)胞的生成，功能表達(dá)，以及對(duì)支架類骨結(jié)構(gòu)的影響。 方法：2個(gè)月昆明鼠全骨髓細(xì)胞與新生鼠原代顱骨成骨細(xì)胞共同培養(yǎng)在含有1，25(OH)<,2>D<,3>的培養(yǎng)液中6天。通過(guò)輕輕吹打新加的介質(zhì)，打下黏附不緊密的細(xì)胞作為pOCs使用。當(dāng)這種細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)板，半小時(shí)后經(jīng)抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色和堿性磷酸酶(ALP)染色，確

3、定pOCs的存在和數(shù)目以及有無(wú)多核細(xì)胞和成骨細(xì)胞的混雜。TRAP熒光染色進(jìn)一步對(duì)結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。通過(guò)融合試驗(yàn)來(lái)研究原代成骨細(xì)胞對(duì)pOCs融合的影響。為了研究成骨細(xì)胞分化程度與pOCs成熟的關(guān)系，成骨細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞被接種到培養(yǎng)板，使用成骨介質(zhì)培養(yǎng)到細(xì)胞匯聚(4d)、礦化開(kāi)始(16d)和高度礦化(28d)，礦化是通過(guò)茜素紅染色來(lái)判定。這三種培養(yǎng)物分別代表骨形成過(guò)程中細(xì)胞增殖、基質(zhì)沉積和成熟以及基質(zhì)礦化。pOCs分別接種到三種培養(yǎng)物

4、，在生長(zhǎng)介質(zhì)中共培養(yǎng)3d。然后進(jìn)行TRAP染色確定類破骨細(xì)胞的形成；纖維肌動(dòng)蛋白(F-actin)熒光染色判斷其吸收活性。在建立破骨細(xì)胞符合生理過(guò)程引入實(shí)驗(yàn)中，MC3T3-E1細(xì)胞首先接種于支架上，在成骨介質(zhì)中培養(yǎng)5w和12w，接著pOCs分別接種到低礦化(5w)和高礦化(12w)支架結(jié)構(gòu)上，在生長(zhǎng)介質(zhì)中培養(yǎng)3d和8d。支架的礦化程度通過(guò)支架上磷含量檢測(cè)來(lái)判定。然后進(jìn)行無(wú)任何處理的環(huán)境掃描電鏡(ESEM)和一般電鏡檢測(cè)(SEM)，觀察類

5、破骨細(xì)胞的形成和功能表達(dá)；支架切片F(xiàn)-actin熒光染色判斷其吸收活性。結(jié)果：在pOCs制備物中，沒(méi)發(fā)現(xiàn)多核細(xì)胞和ALP陽(yáng)性的成骨細(xì)胞，TRAP陽(yáng)性細(xì)胞約占接種細(xì)胞總數(shù)的60％。融合試驗(yàn)表明成骨細(xì)胞的存在對(duì)于pOCs融合是必不可少的。在分析成骨細(xì)胞分化與pOCs成熟關(guān)系實(shí)驗(yàn)中，在高度礦化培養(yǎng)物中，可見(jiàn)到大小不等的礦化結(jié)節(jié)。結(jié)節(jié)的礦化程度可用透光度來(lái)表示。這些結(jié)節(jié)，依其透光度，可分為帶有黑色紋理的不充分礦化結(jié)節(jié)、除邊緣以外全黑的相對(duì)充分礦

6、化結(jié)節(jié)和全黑的充分礦化結(jié)節(jié)。TRAP染色后，在增殖期和剛礦化共培養(yǎng)物中，TRAP陽(yáng)性細(xì)胞分散存在，沒(méi)發(fā)現(xiàn)大于兩個(gè)核的TRAP陽(yáng)性細(xì)胞。在高度礦化共培養(yǎng)物中，可見(jiàn)到TRAP陽(yáng)性細(xì)胞聚集在為數(shù)很少的大的不充分和相對(duì)充分礦化結(jié)節(jié)周?chē)?。約95％大于兩個(gè)核TRAP陽(yáng)性細(xì)胞在這樣的細(xì)胞中存在。這表明pOCs的成熟不僅與基質(zhì)的礦化有關(guān)也與礦化量有關(guān)。聚集在相對(duì)充分礦化結(jié)節(jié)周?chē)腡RAP陽(yáng)性細(xì)胞有向其集中的趨勢(shì)。大的充分礦化結(jié)節(jié)周?chē)鸁o(wú)明顯細(xì)胞聚集現(xiàn)象；

7、但一些原本不透光的結(jié)節(jié)卻有不同程度的TRAP染色。這種TRAP染色結(jié)節(jié)說(shuō)明礦物有吸收；間接反映了所形成的類破骨細(xì)胞有骨吸收活性。細(xì)胞在大礦化結(jié)節(jié)周?chē)植嫉牟町惙从沉嗽诖笮☆愃频那闆r下，結(jié)節(jié)礦化程度越高，對(duì)周?chē)腡RAP陽(yáng)性細(xì)胞的趨化能力越強(qiáng)。F-actin熒光染色顯示了在大礦化節(jié)結(jié)上F-actin環(huán)的出現(xiàn)，這是破骨細(xì)胞具有吸收活性的特征標(biāo)志，直接證明了所形成的類破骨細(xì)胞具有骨吸收活性。在研究破骨細(xì)胞生理引入實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)ESEM和SEM觀

8、察到各種形態(tài)的類破骨細(xì)胞生成。在高度礦化支架結(jié)構(gòu)上(12周)，類破骨細(xì)胞更容易發(fā)現(xiàn)并且尺寸更大；這可能是類破骨細(xì)胞的形成與骨基質(zhì)功能狀態(tài)相適應(yīng)的反映。而且使用ESEM觀察到正在吸收的類破骨細(xì)胞，這個(gè)細(xì)胞展示了面向骨面的細(xì)胞膜特化結(jié)構(gòu)-皺褶緣和封閉區(qū)及其足體，同時(shí)吸收坑也清晰可見(jiàn)。這無(wú)疑表明使用這一策略產(chǎn)生的類破骨細(xì)胞能夠吸收由成骨細(xì)胞在體外產(chǎn)生的類骨基質(zhì)。支架切片F(xiàn)-actin熒光染色顯示了F-actin環(huán)的出現(xiàn)，進(jìn)一步確認(rèn)類破骨細(xì)胞的

9、吸收活性。在原本總是被成骨細(xì)胞異常生長(zhǎng)所形成的膜狀或條索狀結(jié)構(gòu)占據(jù)的支架孔壁上，出現(xiàn)巨大的細(xì)胞融合體。在類破骨細(xì)胞出現(xiàn)的地方，觀察不到明顯的成骨細(xì)胞異常生長(zhǎng)結(jié)構(gòu)。這些現(xiàn)象表明類破骨細(xì)胞能以某種方式去除異常細(xì)胞結(jié)構(gòu)。 結(jié)論：1)通過(guò)機(jī)械分離從破骨細(xì)胞分化培養(yǎng)物中獲取pOCs是一種簡(jiǎn)單、有效的獲取破骨細(xì)胞來(lái)源細(xì)胞的方法。2)在模擬骨組織發(fā)育和形成過(guò)程中，pOCs的成熟需要骨基質(zhì)的形成和累積。3)由pOCs在細(xì)胞礦化支架結(jié)構(gòu)上生成破骨