調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在肝癌荷瘤小鼠體內(nèi)表達(dá)情況的研究.pdf

1、背景：原發(fā)性肝癌(PHC)是我國臨床上最為常見的惡性腫瘤之一，惡性程度高，發(fā)病率正逐年增加，并且其死亡率也在腫瘤相關(guān)死亡率中，位居第二。由于起病隱襲，病人早期一般無明顯臨床癥狀，往往容易被忽視，病情進(jìn)展快，等到出現(xiàn)明顯癥狀時，往往已經(jīng)進(jìn)展到中晚期，失去了手術(shù)機(jī)會，治療困難，預(yù)后不理想。目前，人們對肝癌的發(fā)生機(jī)制還不十分清楚，進(jìn)一步闡明其發(fā)生發(fā)展機(jī)制對提高肝癌的診治水平至關(guān)重要。現(xiàn)代腫瘤學(xué)認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個

2、主要原因之一。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是新近發(fā)現(xiàn)的存在于體內(nèi)的一類具有免疫抑制作用的T細(xì)胞，不僅在維持機(jī)體免疫耐受、移植排斥、感染免疫等方面發(fā)揮著重要作用，而且與腫瘤免疫也密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤病人存在免疫抑制現(xiàn)象。Treg在胃癌，胰腺癌，前列腺癌和乳腺癌等多種腫瘤患者體內(nèi)均有增多，削弱并抑制了機(jī)體的抗腫瘤免疫，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。同樣也有文獻(xiàn)報道Treg在肝癌患者外周血和腫瘤微環(huán)境中表達(dá)增加，而對于脾臟中Treg的變化及肝癌微

3、環(huán)境中局部免疫狀態(tài)，研究甚少。肝癌是如何引起機(jī)體的免疫耐受和抑制抗腫瘤免疫效應(yīng)的產(chǎn)生及機(jī)制仍有待深入了解。本研究選用H22肝癌細(xì)胞株，建立小鼠原位肝癌荷瘤模型，檢測肝癌小鼠脾臟中Treg表達(dá)變化及腫瘤局部微環(huán)境免疫狀態(tài)改變，從而探討Treg在肝癌發(fā)病機(jī)制中的作用，為腫瘤的免疫治療提供新策略。
　　 目的：研究Treg細(xì)胞在肝癌荷瘤小鼠體內(nèi)表達(dá)情況的變化及Treg抑制抗腫瘤免疫效應(yīng)作用的研究。
　　 方法：
　　

4、1.采用小鼠肝癌細(xì)胞系H22接種BALB/C小鼠，建立小鼠肝癌原位模型;
　　 2.采用流式細(xì)胞術(shù)方法檢測肝癌小鼠及對照組小鼠脾臟中CD4+CD25+Treg/CD4+T細(xì)胞的比例;
　　 3.采用免疫組化方法檢測肝癌小鼠及對照組小鼠脾臟中Foxp3+Treg和肝癌組織中Foxp3+Treg及顆粒酶B的表達(dá);
　　 4.采用免疫磁珠分選法純化CD4+CD25+和CD4+CD25-T細(xì)胞;
　　 5.CCK

5、8檢測T細(xì)胞的增殖情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.癌組織切片HE染色示肝臟組織正常結(jié)構(gòu)消失，壞死明顯，細(xì)胞大小不一，排列紊亂，異形性明顯，造模成功率達(dá)100％。
　　 2.肝癌荷瘤小鼠脾臟中CD4+CD25+/CD4+T細(xì)胞（18.78％±1.26％）比例增高，與對照組小鼠（9.99％±1.90％）相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。免疫組化顯示肝癌小鼠脾臟Treg中位數(shù)為181.6個/高倍鏡，正常小鼠為90

6、.6個/高倍鏡，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　 3.免疫組化結(jié)果顯示肝癌組織微環(huán)境中Treg表達(dá)陽性，主要分布在腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞區(qū)，而未見顆粒酶B的表達(dá)。
　　 4.免疫磁珠法分離獲得Treg純度＞90％，CD4+CD25-T細(xì)胞純度＞95％。
　　 5.當(dāng)Treg與CD4+CD25-T細(xì)胞比為1∶4共培養(yǎng)時，抑制率為23.61％，當(dāng)二者比為1∶1時，抑制率為53.95％，純化的Treg在體外能抑制CD