自身凋亡-壞死細(xì)胞對(duì)體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響.pdf

1、凋亡（apoptosis）和壞死（necrosis）是細(xì)胞的兩種主要死亡方式。細(xì)胞凋亡又稱程序化死亡，是生物體內(nèi)普遍存在的生理和病理現(xiàn)象，其特點(diǎn)是細(xì)胞主動(dòng)的、程序化的和耗能的死亡，表現(xiàn)為核固縮、細(xì)胞皺縮、磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）外翻、凋亡小體形成，同時(shí)凋亡細(xì)胞或凋亡小體在體內(nèi)被迅速清除，不引起炎癥反應(yīng)。壞死是細(xì)胞受到化學(xué)、物理或者生物等外界環(huán)境因素的傷害而引起非程序化的、被動(dòng)的和破壞性的細(xì)胞死亡過程，其

2、表現(xiàn)為細(xì)胞能量代謝中止，細(xì)胞膜通透性增高，細(xì)胞腫脹或破裂、細(xì)胞核固縮或碎裂，內(nèi)容物釋放到周圍組織中去，引起炎癥反應(yīng)。 近年來研究發(fā)現(xiàn)，凋亡細(xì)胞在體內(nèi)不僅僅是被清除，而且還會(huì)釋放或者促進(jìn)吞噬細(xì)胞釋放大量的“抗炎性因子”，激活一系列信號(hào)途徑，最終下調(diào)免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)免疫耐受。目前，已經(jīng)證實(shí)，凋亡細(xì)胞在自身免疫、腫瘤免疫、感染免疫以及移植免疫等過程中均發(fā)揮重要的作用。凋亡細(xì)胞吞噬障礙可以引起自身免疫病，而腫瘤的發(fā)生發(fā)展也與凋亡異常有關(guān)，

3、供體凋亡細(xì)胞還能夠誘導(dǎo)嚙齒類動(dòng)物的移植免疫耐受。但是，目前對(duì)于凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受在機(jī)制還不是很清楚。 與凋亡細(xì)胞不同的是，壞死細(xì)胞可以啟動(dòng)免疫應(yīng)答反應(yīng)。壞死細(xì)胞在體內(nèi)被吞噬后，可以促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的活化（dendritic cell，DC）；壞死細(xì)胞與巨噬細(xì)胞（macrophage，M（））共培養(yǎng)后，可以提高巨噬細(xì)胞的抗腫瘤能力，壞死細(xì)胞同時(shí)可以刺激M（）分泌大量炎性因子。此外，壞死細(xì)胞本身也會(huì)釋放“危險(xiǎn)信號(hào)”，活化固有免疫，啟

4、動(dòng)免疫反應(yīng)。 凋亡和壞死同為細(xì)胞死亡方式，對(duì)免疫系統(tǒng)的影響卻如此不同，這也引起了普遍關(guān)注。凋亡和壞死兩者之間到底有什么樣的聯(lián)系，目前還未有定論。就當(dāng)前研究進(jìn)展來看，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）在凋亡誘導(dǎo)的免疫耐受中起著非常重要的作用。Treg是一組具有抑制其它免疫細(xì)胞功能的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，現(xiàn)已被證明在各種不同免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)過程中都不可或缺。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)靜脈輸注凋亡細(xì)胞可以升高Treg，而去除Treg后

5、，凋亡細(xì)胞將不能誘導(dǎo)免疫耐受。此外，Treg的產(chǎn)生和增長(zhǎng)都依賴轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factorβ，TGF-β），而凋亡細(xì)胞被吞噬后恰好會(huì)產(chǎn)生大量的TGF-β。然而，壞死細(xì)胞與Treg的關(guān)系目前還不清楚。 凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受的作用現(xiàn)在被相當(dāng)多的免疫學(xué)研究者寄望于解決移植排斥問題，但是目前僅僅在嚙齒類動(dòng)物上有良好的進(jìn)展。在大動(dòng)物尤其是非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物上，還未有突破。關(guān)鍵在于目前對(duì)凋亡/壞死作用于免

6、疫系統(tǒng)的很多機(jī)制沒搞清楚。Treg的發(fā)現(xiàn)和凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受研究的進(jìn)展，無疑是對(duì)原有免疫學(xué)“克隆選擇學(xué)說”理論的重大挑戰(zhàn)。顯然，進(jìn)一步在靈長(zhǎng)類動(dòng)物上研究凋亡細(xì)胞和Treg的關(guān)系，將有利于探討凋亡細(xì)胞誘導(dǎo)免疫耐受的臨床研究；而同時(shí)研究壞死細(xì)胞和Treg的影響，則有助于理解不同方式死亡的細(xì)胞對(duì)免疫耐受和免疫應(yīng)答平衡的不同調(diào)節(jié)作用，并掌握不同死亡細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫的關(guān)鍵細(xì)胞和關(guān)鍵分子，從而為臨床上有效地調(diào)控免疫反應(yīng)提供思路。 目的：

7、 1.研究誘導(dǎo)恒河猴外周血單個(gè)核細(xì)胞凋亡的方法； 2.觀察凋亡細(xì)胞聯(lián)合雷帕霉素對(duì)恒河猴體內(nèi)Treg的影響； 3.研究壞死細(xì)胞對(duì)小鼠體內(nèi)Treg的作用，以及H2O2處理后的壞死細(xì)胞對(duì)Treg的影響。 方法： 1.抽取恒河猴靜脈血，梯度密度分離法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞。采用紫外線照射法誘導(dǎo)凋亡，摸索不同照射時(shí)間、不同孵育時(shí)間以及是否照射時(shí)增加震蕩等誘導(dǎo)凋亡的條件。細(xì)胞凋亡率的判斷使用異硫氰熒光素（fluore

8、scein isothiocyannate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的鈣磷脂結(jié)合蛋白V（Annexin V）和碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。 2.四只恒河猴分為兩組，實(shí)驗(yàn)組每天給予口服0.4mg雷帕霉素，并靜脈輸注凋亡細(xì)胞一次，細(xì)胞數(shù)目約3.5×107個(gè)；對(duì)照組每天給予同樣劑量雷帕霉素，并注射PBS一次。定期檢測(cè)各組恒河猴外周血中CD4+Foxp3+Treg，并計(jì)算Treg占CD4+T細(xì)胞的比例。

9、對(duì)比兩組恒河猴Treg變化曲線的異同。 3.將36只6周齡SPF級(jí)Balb/C小鼠隨機(jī)分為四組。第一組為壞死細(xì)胞組（n=10），尾靜脈注射2×107個(gè)（200μl）未經(jīng)任何處理的壞死細(xì)胞；第二組為H2O2處理壞死細(xì)胞組（n=10），尾靜脈注射50mM H2O2處理后的壞死細(xì)胞2×107個(gè)；第三組為PBS+H2O2對(duì)照組（n=10），尾靜脈注射含50mM H2O2的PBS200μl；第四組為空白對(duì)照組（n=6），不做任何處理。2周

10、后處死小鼠，檢測(cè)外周血、脾臟、胸腺中CD4+ Foxp3+ Treg，并計(jì)算Treg占CD4+T細(xì)胞的比例。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS16.0軟件進(jìn)行單向方差分析，分別比較各組間外周血、脾臟和胸腺中的Treg比例和Treg占CD4+T細(xì)胞的比例有無差異，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示。 （1）壞死細(xì)胞的制備 5周齡SPF級(jí)Balb/C小鼠3只，處死后迅速取出胸腺研磨，PBS洗滌制備細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度后56℃

11、水浴1小時(shí)。壞死率判斷使用Annexin VFITC和PI染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。 （2）調(diào)節(jié)性T細(xì)胞檢測(cè) 采用美國(guó)eBioscience公司推薦的Treg檢測(cè)方法，抗小鼠CD4單克隆抗體標(biāo)記后，eBioscience公司專用打孔/固定液處理細(xì)胞，每份樣本再分為兩管，一管加入抗小鼠Foxp3單克隆抗體，另一管加入同型對(duì)照IgG2b。4℃避光孵育1小時(shí)后流式細(xì)胞儀檢測(cè)。 結(jié)果： 1.紫外線（UVC）照射法誘導(dǎo)

12、恒河猴外周血單個(gè)核細(xì)胞凋亡。采用RPMI1640培養(yǎng)基加10%小牛血清重懸細(xì)胞，紫外線20cm距離照射1小時(shí)，同時(shí)震蕩細(xì)胞，然后孵育15小時(shí)可獲得滿意凋亡率。總凋亡率在95%以上。 2.凋亡細(xì)胞聯(lián)合雷帕霉素升高恒河猴體內(nèi)CD4+Foxp3+Treg占CD4+T細(xì)胞的比例。單純口服雷帕霉素的兩只恒河猴，Treg/CD4+T比例在一只猴未見有明顯增加，在第38天為6.92%，另一只僅在4周后明顯增加，在第38天為13.7%；而注射凋

13、亡細(xì)胞聯(lián)合雷帕霉素組的兩只恒河猴，其Treg/CD4+T的比例在輸注凋亡細(xì)胞后大約2-3周即有明顯增加，兩只猴在第38天Treg/CD4+T細(xì)胞比例升至16.67%和21.56%。 3.壞死細(xì)胞處理后小鼠CD4+Foxp3+Treg的比例。 應(yīng)用不同的處理方法處理小鼠后兩周，檢測(cè)小鼠不同淋巴組織中的小鼠CD4+Foxp3+Treg占淋巴細(xì)胞比例。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在脾臟中，空白對(duì)照組為（3.80±0.24）%，PBS+H2O2對(duì)

14、照組為（3.41±0.64）%，壞死細(xì)胞組為（2.75±0.38）%。壞死細(xì)胞組與空白對(duì)照組和PBS+H2O2對(duì)照組相比顯著降低（F=6.895，Pvs空白=0.000，Pvs PBS+H2O2=0.004）。而H2O2處理壞死細(xì)胞組為（3.42±0.49）%，與壞死細(xì)胞組相比顯著增高（F=6.895，P=0.004），但與空白對(duì)照和PBS+H2O2對(duì)照組相比無顯著差異（F=6.895，Pvs空白=0.139，PvsPBS+H2O2=0

15、.948）。表明H2O2處理后的壞死細(xì)胞消除了后者降低CD4+Foxp3+Treg的作用。在外周血和胸腺中，均未見各組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Fblood=0.337，Pblood=0.799； Fthymus=0.507，Pthymus=0.680）。CD4+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞比例：在小鼠外周血、脾臟、胸腺中，各組CD4+T細(xì)胞占淋巴細(xì)胞比例未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 然后我們觀察了CD4+Foxp3+ Treg占CD4+T細(xì)胞比例：外周血中，空

16、白對(duì)照組為（7.09±1.93）%，PBS+H2O2對(duì)照組為（8.46±2.48）%，壞死細(xì)胞組為（6.19±1.62）%，H2O2處理壞死細(xì)胞組為（6.34±1.05）%?？瞻讓?duì)照組與PBS+H2O2對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=2.887，P=0.166）。壞死細(xì)胞組與H2O2處理壞死細(xì)胞組相比PBS+H2O2對(duì)照組均有顯著降低（F=2.887，P壞死=0.013，PH2O2+壞死=0.020）。在脾臟，空白對(duì)照組為（16.74±1.54

17、）%，PBS+H2O2對(duì)照組為（14.16±3.27）%，壞死細(xì)胞組為（10.15±2.64）%，壞死細(xì)胞組與空白對(duì)照組或PBS+H2O2對(duì)照組相比均顯著降低（F=8.482； Pvs空白=0.000，Pvs PBS+H2O2=0.002）；H2O2處理壞死細(xì)胞組為（12.81±2.44）%，比壞死細(xì)胞組有增高（F=8.482，P=0.043），但仍低于空白對(duì)照組水平（F=8.482，P=0.007）。在胸腺未見各組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F