石蠟包埋肝細(xì)胞癌組織中RASSF1A、APC、WIF-1基因甲基化檢測(cè)及其臨床意義.pdf

1、目的：肝細(xì)胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是我國(guó)常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，近年來(lái)其發(fā)病率仍有上升趨勢(shì)，然而其確切的發(fā)病機(jī)制目前仍不十分清楚。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，抑癌基因甲基化在腫瘤形成和發(fā)展中的作用越來(lái)越受到重視。抑癌基因RASSF1A和APC分別是Ras和Wnt信號(hào)途徑中的分子，它們的甲基化在肝細(xì)胞癌發(fā)生中的作用以往已有一些研究報(bào)道，但是研究結(jié)論還很不一致，這兩個(gè)基因的甲基化檢測(cè)用于臨床還存在一定問(wèn)

2、題；而抑癌基因WIF-1作為Wnt信號(hào)途徑中的另一個(gè)分子，其在肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及臨床意義的報(bào)道較少。抑癌基因RASSF1A，APC，WIF-1啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化檢測(cè)以往研究多采用新鮮組織，但新鮮組織長(zhǎng)時(shí)間保存困難，大樣本、長(zhǎng)周期的研究受到限制，因此，本研究以石蠟包埋的肝細(xì)胞癌組織為標(biāo)本，采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)( methylation specific PCR，MSP)檢測(cè)RASSF1A，APC和WIF-1基因的甲基化狀

3、態(tài)，分析與臨床資料、病理學(xué)資料及生存期預(yù)后的關(guān)系，為抑癌基因RASSF1A，APC和WIF-1甲基化檢測(cè)的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，驗(yàn)證石蠟包埋肝細(xì)胞癌組織中RASSF1A和APC基因的甲基化狀態(tài)的臨床意義，闡明WIF-1基因甲基化在肝細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，以期用于臨床診斷及預(yù)后判斷。
　　 方法：
　　 1 研究資料：收集自2002年1月～2010年6月于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院行肝膽外科手術(shù)治療的肝細(xì)胞癌組織97例，癌旁

4、肝硬化組織26例。97例肝細(xì)胞癌組織中男性81例，女性16例，年齡在24～75歲，平均年齡為55.69±10.21歲。所有標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，HE染色，病理診斷由2名病理科醫(yī)師診斷證實(shí)。收集所有患者相關(guān)病史、實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果、臨床病理學(xué)資料和腫瘤家族史，通過(guò)電話聯(lián)系或信訪的方式對(duì)肝細(xì)胞癌患者隨訪其生存情況。
　　 2 抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化檢測(cè)方法：蠟塊組織總DNA采用傳統(tǒng)的酚-氯仿方法提取，經(jīng)亞硫酸鹽處理后，用WizardDN

5、A純化試劑盒純化組織DNA，采用甲基化特異性PCR的方法對(duì)抑癌基因RASSF1A，APC和WIF-1進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)電泳凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行甲基化結(jié)果分析判定。
　　 3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)均使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，生存期采用Kaplan-Meier法計(jì)算，單因素分析采用Log-rank檢驗(yàn)。均采用雙側(cè)檢驗(yàn)，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　

6、結(jié)果：
　　 1 肝細(xì)胞癌和肝硬化組織中RASSF1A，APC，WIF-1基因甲基化表達(dá)及比較
　　 RASSF1A基因的甲基化率在肝細(xì)胞癌組及肝硬化組中分別為67.01％(65/97)，42.31％(11/26)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 APC基因在肝細(xì)胞癌組和肝硬化組中的甲基化率分別為63.92％(62/97)，42.31％(11/26)，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。<

7、br>　　 WIF-1基因在肝細(xì)胞癌組和肝硬化組中的甲基化率分別為46.39％(45/97)，7.69％(2/26)，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 2 肝細(xì)胞癌患者中RASSF1A，APC，WIF-1基因甲基化與臨床資料的比較
　　 RASSF1A基因的甲基化陽(yáng)性率在男、女患者中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。女性患者中APC基因甲基化陽(yáng)性率為37.5％(6/16)，低于男性的甲基化陽(yáng)性率69.14

8、％(56/81)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。WIF-1基因的甲基化陽(yáng)性率女性為18.75％(3/16)，低于男性的甲基化陽(yáng)性率51.85％(42/81)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。RASSF1A，APC，WIF-1基因的甲基化陽(yáng)性率與患者的年齡分組、肝功能Child-pugh分級(jí)和血清AFP值的大小間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。HBsAg陽(yáng)性組RASSF1A基因的甲基化陽(yáng)性率為72.84％(59/81)，HBsA

9、g陰性組的甲基化陽(yáng)性率為23.08％(3/13)，兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);APC和MF-1基因在HBsAg陽(yáng)性和陰性組中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。RASSF1A基因的甲基化陽(yáng)性率在伴有肝硬化的組織中為71.11％(64/90)，顯著大于無(wú)肝硬化的組織14.28％(1/7)，兩組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；APC及WIF-1基因中的甲基化陽(yáng)性率在有無(wú)肝硬化組中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

10、　　 3 肝細(xì)胞癌患者中RASSF1A，APC，WIF-1基因甲基化與病理學(xué)資料的比較
　　 RASSF1A，APC，WIF-1基因的甲基化陽(yáng)性率與腫瘤的個(gè)數(shù)及腫瘤直徑無(wú)關(guān)(P＞0.05)。有假包膜組RASSF1A，APC基因的甲基化陽(yáng)性率與無(wú)假包膜組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);WIF-1基因的甲基化陽(yáng)性率在有假包膜組為40％(30/75)，顯著低于無(wú)假包膜組68.18％(15/22)，兩組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.

11、05)。門(mén)脈瘤栓的有無(wú)及臨床分期兩組中三個(gè)基因的甲基化陽(yáng)性率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 4 肝細(xì)胞癌組織中RASSF1A，APC，WIF-1基因甲基化陽(yáng)性表達(dá)的相互關(guān)系
　　 97例肝細(xì)胞癌中三個(gè)抑癌基因均未甲基化的占11.34％(11/97)，至少有一個(gè)基因甲基化的占88.66％(86/97)，同時(shí)有兩個(gè)基因甲基化的占64.95％(63/97)，三個(gè)基因均發(fā)生甲基化的占23.71％(23/97)。采用P

12、earson相關(guān)分析肝細(xì)胞癌組織中RASSF1A，APC，WIF-1基因甲基化表達(dá)的關(guān)聯(lián)程度，發(fā)現(xiàn)三個(gè)抑癌基因甲基化表達(dá)均不存在相關(guān)關(guān)系(P＞0.05)。
　　 5 抑癌基因RASSF1A，APC，WIF-1的甲基化陽(yáng)性表達(dá)與生存期預(yù)后關(guān)系
　　 對(duì)97例肝細(xì)胞癌患者進(jìn)行電話或通信的方式隨訪其生存情況，隨訪至2011年3月，隨訪時(shí)間1～105月，其中9例患者失訪。該組1年、2年、3年生存率分別為57.3％，42.1％，3

13、5.4％。
　　 RASSF1A基因甲基化陰性的肝細(xì)胞癌患者1年、2年、3年生存率分別為56.3％，43％，39.7％，甲基化陽(yáng)性者1年、2年、3年生存率分別為57.8％，40.1％，31.6％;APC基因甲基化陰性者1年、2年、3年生存率分別為54.3％，31.4％，25.7％，甲基化陽(yáng)性者1年、2年、3年生存率分別為59％，46.8％，39.5％;WIF-1基因甲基化陰性者1年、2年、3年生存率分別為57.6％，45.6％，

14、37.3％，甲基化陽(yáng)性者1年、2年、3年生存率分別為56.9％，35.7％，30.7％。單因素分析顯示，RASSF1A，APC，WIF-1基因的甲基化狀態(tài)間生存率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1 石蠟包埋肝細(xì)胞癌組織中可檢測(cè)到RASSF1A，APC和WIF-1基因甲基化，檢測(cè)結(jié)果可靠，石蠟包埋組織的甲基化檢測(cè)有其可行性。
　　 2 肝細(xì)胞癌組織較肝硬化組織RASSF1A，APC，WI

15、F-1基因甲基化率高，提示抑癌基因RASSF1A，APC和WIF-1的甲基化在肝細(xì)胞癌的發(fā)生中起到一定作用。
　　 3 肝細(xì)胞癌組織中RASSF1A基因在HBsAg陽(yáng)性組中的甲基化率高于HBsAg陰性組，在伴有肝硬化組中甲基化率高于不伴有肝硬化組，而APC和WIF-1基因的甲基化率與HBsAg感染和有無(wú)肝硬化無(wú)關(guān)，說(shuō)明RASSF1A基因甲基化檢測(cè)有望用于肝細(xì)胞癌高危人群的篩查。
　　 4 抑癌基因RASSF1A，APC，