青貯過程中苜蓿蛋白的降解特性及化學(xué)添加劑對(duì)其影響.pdf

1、苜蓿(Medicago．sativa L．)青貯是解決苜蓿在干草調(diào)制過程中由于雨淋、葉片脫落等造成損失的有效措施。但苜蓿在青貯時(shí)，其中的蛋白被大量降解形成非蛋白氮，而非蛋白氮不能被反芻家畜有效地利用，所以苜蓿青貯料相對(duì)于苜蓿鮮草和干草其蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較低。本研究對(duì)苜蓿在青貯過程中蛋白的降解以及單寧酸、甲酸和甲醛等對(duì)苜蓿青貯過程中蛋白降解的抑制機(jī)理做了探討，并分析了苜蓿青貯后其粗蛋白、氨基酸組成的變化，蛋白降解所形成肽的種類及不同添加劑對(duì)

2、其的影響。在此基礎(chǔ)上，利用體外法對(duì)苜蓿青貯料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值做了初步評(píng)價(jià)。 試驗(yàn)一苜蓿青貯過程中氮組分和蛋白降解酶的變化及添加劑對(duì)其的影響研究了苜蓿青貯過程中甲酸、甲醛及單寧酸對(duì)苜蓿青貯料中氮的組分及植物蛋白降解酶活性的變化的影響。苜蓿(DM為30％)在青貯前的處理為添加甲酸(4g·kg<'-1>DM)，甲醛(1g·kg<'-1>DM)和兩個(gè)水平的單寧酸(20 and 50g·kg<'-1>DM)，并以朱添加添加劑的苜蓿為對(duì)照。苜蓿在

3、青貯開始到第7天時(shí)，與其它添加劑處理相比，甲酸能夠有效地抑制蛋白的降解。單寧酸沒有甲酸和甲醛抑制蛋白降解形成非蛋白氮、氨態(tài)氮和游離氨基酸氮的效果好，但從青貯開始到青貯35天的過程中，添加高水平的單寧酸處理組苜蓿青貯料中非蛋白氮和游離氨基酸氮的增加量要低于對(duì)照組和其它添加劑處理組。苜蓿青貯過程中，蛋白降解酶羧基肽酶隨青貯時(shí)間的延長(zhǎng)其活性降低的較慢，而且在青貯第2天時(shí)仍保持79％的活性。青貯21天后，羧基肽酶在對(duì)照組，甲酸處理組，甲醛處理組

4、及2％和5％單寧酸處理組苜蓿青貯料中的活性分別為苜蓿鮮草酶活性的的41％，49％，10％，30.5％和30％。酸性蛋白降解酶在青貯第21天時(shí)也保持較高的活性，而對(duì)照組中氨基肽酶則在青貯第7天時(shí)就失活，添加劑處理的苜蓿青貯料中其蛋白酶活在青貯第4天時(shí)就失活。 試驗(yàn)二苜蓿青貯過程中蛋白分子質(zhì)量分布的變化采用SDS-PAGE不連續(xù)電泳方法研究了苜蓿青貯不同時(shí)間，即0，1，3，5，7，14，21，35天時(shí)青貯料中蛋白分子質(zhì)量分布的變化。

5、結(jié)果表明，苜蓿青貯料中分子量在43.0kDa～97.4 kDa范同內(nèi)的蛋白從青貯青貯的第1天至青貯的第35天之間變化不是很明顯，而且在青貯的第35天時(shí)有些蛋白才被降解。而分子量在31kDa～43 kDa范圍內(nèi)的蛋白從青貯的第1天至青貯第14天這段時(shí)間中逐漸減少，但之后從青貯的第21天至35天時(shí)義開始增加。分子量在31kDa以下的蛋白在青貯第5天后被大部分降解。同時(shí)，從第1天、第3天和第5天的蛋白帶也可以看出，苜蓿青貯料中分子量在20.1

6、kDa～31kDa范圍內(nèi)的蛋白的降解速度要高于分子量小于20.1kDa的蛋白。上述結(jié)果說明，苜蓿在青貯時(shí)其中的酶蛋白和細(xì)胞質(zhì)及葉綠體可溶性蛋白被人部分降解，而剩余的蛋白人部分為葉綠體膜蛋白。 試驗(yàn)三苜蓿青貯料肽分子質(zhì)量分布及不同添加劑對(duì)其的影響采用凝膠(Sephadex-625，中級(jí))層析過濾法分析了苜蓿青貯料中蛋白降解所形成肽的大小及不同添加劑對(duì)其的影響。苜蓿青貯時(shí)的處理為甲酸處理組(4g·kg<'-1>DM)，甲醛處理組(1

7、g·kg<'-1>DM)，單寧酸(50g·kg<'-1>DM)處理組及對(duì)照組，青貯時(shí)間為35天。將每個(gè)處理組的苜蓿青貯料制成不含蛋白的浸提液后進(jìn)行層析分析。層析柱(直徑×高度，26mm×900mm)的總體積為475ml，層析速度為0.5ml/min，并以VB12(MW:1350)、還原型谷胱甘肽(MW:612)和氧化型谷胱甘肽(MW:307)為標(biāo)準(zhǔn)物。試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組苜蓿青貯料浸提液中的肽多為小肽，即二肽和三肽。而甲酸處理的苜蓿浸提

8、液中多為3-7個(gè)氨基酸殘基的寡肽，而小肽的含量較少。甲醛和單寧酸處理的苜蓿浸提液中的肽鏈多為含有3-4個(gè)氨基酸殘基的寡肽。同時(shí)，甲醛處理的苜蓿浸提液中也含有一定量的7個(gè)氨基酸殘基以下的寡肽。從洗脫峰的面積來看，添加劑處理組苜蓿浸提液中肽的含量均高于對(duì)照組苜蓿浸提液中肽的含量，而且各處理苜蓿浸提液中的肽均為小于10個(gè)氨基酸殘基的寡肽。 試驗(yàn)四化學(xué)添加劑對(duì)苜蓿青貯粗蛋白及氨基酸組成的影響根據(jù)康乃爾凈碳水化合物和蛋白質(zhì)體系，研究了甲酸

9、，甲醛，單寧酸及這三種添加劑兩兩混合處理對(duì)苜蓿青貯料中粗蛋白、氨基酸紐成的影響。苜蓿在青貯40天后，其中的人多數(shù)真蛋白轉(zhuǎn)變成了 Fraction A 即非蛋白氮，該粗蛋白組分不能被家畜有效地利用。而所有添加劑處理，特別時(shí)甲酸/甲醛混合處理組顯著降低了青貯料中 Fraction A 的含量(P<0.05)。真蛋白組分Faation B1 在添加劑特別是甲醛處理組苜蓿青貯料中的含量顯著高丁其在對(duì)照組苜蓿青貯料中的含量(P<0.05)。而在甲

10、酸/甲醛和單寧酸/甲醛混合處理的苜蓿青貯料中大部分真蛋白分別為Fraction B3 和Fraction B2。除了甲醛或單寧酸處理的苜蓿青貯料外，對(duì)照組苜蓿青貯料中的不能被家畜消化利用的真蛋白組分Fraction c的含量與其它添加劑處理組中的含量差異不顯著(P>0.05)。與對(duì)照組相比，苜蓿青貯料中的氨基酸在添加劑處理組苜蓿青貯料中能夠被很好地得到保存不被降解形成氨態(tài)氮。而且甲酸處理的苜蓿青貯料中總的氨基酸含量商于對(duì)照組和其它添加劑

11、處理的苜蓿青貯料中的含量。從單個(gè)氨基酸的變化來看，苜蓿青貯過程中一些支鏈氨基酸(如亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)和蛋氨酸能夠較好的保存，而酸性和堿性氨基酸(如谷氨酸、苯丙氨酸和精氨酸等)則大部分被降解。 試驗(yàn)五苜蓿青貯料體外消化特性及不同添加劑對(duì)其的影響采用活體外兩階段法研究了苜蓿凍干樣，苜蓿干草及苜蓿青貯料凍干樣的DM，CP，NDF及ADF的體外消失率。苜蓿青貯干樣分別為青貯時(shí)添加甲酸，甲醛，單寧酸，甲酸+單寧酸，甲醛+單寧酸，甲

12、酸+甲醛及對(duì)照組苜蓿青貯料。與苜蓿凍干樣和苜蓿干草相比，對(duì)照組苜蓿青貯料的DM，CP和NDF的體外消失率均較高。各添加劑處理降低了苜蓿青貯料中干物質(zhì)的體外消化率。對(duì)照組CP的體外消化率顯著高于其它添加劑處理組苜蓿青貯料的CP(P<0.05)，而甲酸、甲醛單獨(dú)處理組與甲酸和甲醛及甲酸利單寧酸混合處理組之間其CP的體外消化率差異不顯著(P>0.05)。除了甲酸和單寧酸混合處理組外，對(duì)照組苜蓿青貯料其ADF的體外消化率與其它各添加劑處理組之間