腎素（原）受體在大鼠腎小球系膜細胞和糖尿病大鼠腎臟的表達和調(diào)控.pdf

1、本文的目的是探討大鼠腎臟系膜細胞是否表達RnR，如果表達RnR，則RnR的生物學功能有哪些，RnR的表達受哪些因素調(diào)控；并且探討糖尿病腎病時腎臟內(nèi)RnR的表達是否發(fā)生改變，如果發(fā)生改變，則這種改變在糖尿病腎病的發(fā)生中是否起作用。 我們的實驗主要分以下三部分： 第一部分：觀察在體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞和正常Sprague-Dawley(SD)大鼠腎臟中是否表達RnR，以及RnR在大鼠腎小球系膜細胞中的功能。首先，建立大

2、鼠腎小球系膜細胞(MCs)株的培養(yǎng)方法，鑒定細胞株的特性，為進一步進行系膜細胞各種生物學特性及糖尿病腎病研究奠定基礎(chǔ)。大鼠腎小球系膜細胞株由復(fù)旦大學上海醫(yī)學院病理系郭慕依教授增予。用倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)學特征；用免疫細胞化學方法顯示腎小球系膜細胞特異性表面標志。用RT-PCR，Western blotting確定系膜細胞和腎臟RnR mRNA和蛋白的存在；利用免疫熒光技術(shù)確定 RnR 表達的部位。實驗結(jié)果顯示：用光學顯微鏡觀察，

3、體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞呈梭形、不規(guī)則星形或三角形。胞漿內(nèi)結(jié)蛋白和肌動蛋白均為陽性，而第Ⅷ因子則為陰性。體外培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞和SD大鼠腎臟中均有RnR mRNA和蛋白表達；在系膜細胞中，RnR主要存在于核周區(qū)域和細胞膜上：在大鼠腎臟中，RnR主要存在于腎臟皮質(zhì)腎小球系膜區(qū)。以上結(jié)果表明，培養(yǎng)的大鼠腎小球系膜細胞具有其特征性形態(tài)和免疫組化的特異性表面標志，可以用于進一步的研究。在整體動物實驗中證實，RnR存在于腎小球系膜區(qū)，與

4、體外培養(yǎng)的腎小球系膜細胞存在RnR一致。為進一步闡明生理及病理狀態(tài)下RnR在系膜細胞中的功能，我們用RnR的多肽抑制劑一腎素原柄區(qū)肽(HRP)和RNA干擾(RNAi)技術(shù)對正常狀態(tài)下的系膜細胞以及血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)和高葡萄糖(30mM)刺激的系膜細胞的功能進行了觀察。結(jié)果如下： 一、通過RT-PCR．和放射免疫方法確定，在系膜細胞內(nèi)和細胞培養(yǎng)液中有腎素mRNA和腎素活性的存在。用合成的HRP以及FITC標記的HRP(FI

5、TC-HRP)觀察HRP進入細胞內(nèi)并與RnR結(jié)合的情況，證實HRP可以進入系膜細胞，并與RnR結(jié)合。 二、在正常狀態(tài)下的系膜細胞中，用Western blotting方法觀察到，給予HRP(10<'-6>M)后，細胞內(nèi)ERK1/2的磷酸化水平迅速降低；給予不同濃度的HRP24小時、48小時和72小時，用real-time RT-PCR觀察到系膜細胞轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)mRNA表達顯著降低：用5-溴-2’脫氧尿嘧啶(B

6、rdU)細胞增殖酶聯(lián)免疫吸附劑盒(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)觀察到，HRP(10<'-6>M和10<'-7>M)可抑制系膜細胞增殖；用明膠酶譜法觀察到，HRP(10<'-8>M，10<'-7>M和10<'-6>M)可以增加基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)活性，并且呈劑量依賴性。 三、在正常狀態(tài)下的系膜細胞中，針對RnR進行RNAi，觀察siRNA對系膜細胞的增殖和分泌的影響。

7、設(shè)計并體外合成針對大鼠RnR基因(GenBankAccession ABl88298)的siRNA序列，應(yīng)用real-time RT-PCR及Westemblotting方法檢測RnR基因和蛋白的表達情況，確定siRNA干擾效率大于75％后，觀察到在轉(zhuǎn)染siRNA72小時后TGF-β1 mRNA表達降低，系膜細胞增殖受到抑制；MMP-2蛋白總量和MMP-2活性均增加；細胞培養(yǎng)液中Ⅳ型膠原的分泌量明顯減少。以上結(jié)果與HRP阻斷劑的作用一致

8、，說明干擾RnR表達后，可以抑制系膜細胞增殖和細胞外基質(zhì)(ECM)的分泌。以上的結(jié)果支持這樣的假設(shè)：在系膜細胞中，RnR具有促細胞增殖和促ECM分泌的作用。 四、觀察HRP對Ang Ⅱ的細胞效應(yīng)的影響。在實驗中我們觀察到：Ang Ⅱ可促使系膜細胞增殖，TGF-β 1 mRNA表達增加，MMP-2活性降低。如同時給予HRP，可以對抗以上這些由Ang Ⅱ刺激引起的細胞效應(yīng)。以上結(jié)果說明：抑制RnR可以對抗Ang Ⅱ引起的促細胞增殖和

9、降低基質(zhì)降解的效應(yīng)。因此可推測，Ang Ⅱ?qū)ο的ぜ毎拇僭鲋澈痛俜置谧饔每赡苁峭ㄟ^RnR介導的。 五、觀察HRP對高葡萄糖的細胞效應(yīng)的影響。在實驗中我們觀察到:高葡萄糖(30raM)可促使系膜細胞TGF-β 1 mRNA表達增加，MMP-2活性降低。HRP可以對抗以上這些高葡萄糖引起的細胞效應(yīng)。以上結(jié)果表明，RnR介導了高葡萄糖對系膜細胞的促生長和促分泌作用。 第二部分: Ang Ⅱ和高葡萄糖對系膜細胞RnR表達的調(diào)控。

10、 一、Ang Ⅱ?qū)ο的ぜ毎鸕nR表達的影響。不同濃度的Ang Ⅱ(10<'-8>M，10<'-7>M和10<'-6>M)可使系膜細胞RnR mRNA和蛋白表達減少，此作用被Ang Ⅱ的2型受體(AT2R)拮抗劑(PD123319)阻斷，但不能被Ang Ⅱ的1型受體(AT<,1>R)拮抗劑(losartan)阻斷。AT2R的激動劑(CGP42112A)也可使系膜細胞表達RnR減少。另外，Ang Ⅱ可以降低系膜細胞腎素mRNA表達水

11、平，給予PD123319可以阻斷Ang Ⅱ的這種作用，而且CGP42112A(10<'-8>M和10<'-7>M)也可以降低腎素mRNA表達水平。這些結(jié)果表明，Ang Ⅱ可能通過AT<,2>R(而不是AT<,1>R)使RnR表達減少. 二、高葡萄糖對系膜細胞RnR表達的影響。高葡萄糖(30mM)使系膜細胞RnRmRNA和蛋白的表達減少，此作用被AT<,2>R拮抗劑(PDl23319)阻斷，但不能被AT<,1>R)拮抗劑(losa

12、rtan)阻斷。另外，高葡萄糖使系膜細胞AT2RmRNA表達水平增高，而AT<,1>R mRNA表達水平?jīng)]有明顯變化。這些結(jié)果表明，高葡萄糖可以通過某些途徑使RnR表達減少；同時高葡萄糖使AT<,2>R表達增加，這至少可能是高葡萄糖使RnR表達減少的機制之一。 第三部分：研究RnR在正常SD大鼠和鏈尿佐菌素(STZ)誘發(fā)的糖尿病大鼠腎臟中的表達，以及STZ糖尿病大鼠經(jīng)losartan治療的腎臟中RnR表達的變化。 一、觀

13、察在STZ誘發(fā)的糖尿病大鼠腎臟中RnR mRNA表達的變化。首先建立STZ誘導的糖尿病大鼠模型，將80只SD雄性大鼠分為正常對照組(C組，n=40)和糖尿病組(DM組，n=40)。每個時間點每組各8只大鼠。實驗結(jié)果：給予一次腹腔注射STZ誘發(fā)糖尿病，DM組血糖高于16.7mM，體重明顯減輕，尿量增加，尿蛋白排出量增多，從6W開始形態(tài)學觀察DM組大鼠腎臟出現(xiàn)不同程度的腎小球基底膜增厚、腎小球系膜區(qū)增寬、系膜細胞增生、基質(zhì)增多等損害。在五個

14、不同時間點(1，3，6，12，24周)時，DM組腎臟中RnR mRNA水平均比C組低(P<0.05)。RAS其他成分變化如下：DM組大鼠血漿腎素活性較C組明顯降低(P<0.05)；DM組大鼠血漿Ang Ⅱ較C組明顯升高(P<0.05)；DM組大鼠腎臟組織Ang Ⅱ較C組明顯升高(P<0.05)。以上結(jié)果表明，糖尿病大鼠腎臟中RnR的表達明顯降低。 二、觀察losartan治療后的STZ誘導的糖尿病大鼠腎臟中RnR mRNA表達變

15、化。將24只雄性SD大鼠分為三組，每組8只：正常對照組、糖尿病未治療組、糖尿病losartan治療組。其中l(wèi)osartan治療組是在給予STZ處理后一周，血糖高于16.7mM的大鼠給予losartan20mg/kg/d灌胃，持續(xù)6周，正常對照組(C組)和糖尿病未治療組(DM組)給予等量雙蒸水灌胃。于STZ處理后1、3、5、7周(即losartan治療0，2，4，6周)測定各組大鼠血糖、體重、血壓、尿量、尿蛋白排出量、血漿肌酐，于治療第6

16、周處死大鼠取腎臟組織。結(jié)果：losartan治療2周后，losartan治療組的尿蛋白排出量和血肌酐較糖尿病未治療組減少(P<0.05)。RAS成分變化：DM組腎臟中RnR mRNA水平均比C組低(P<0.05)，losartan治療組RnR mRNA水平均比C組和DM組低(P<0.05)。此外，DM組腎臟中AT2RmRNA水平比C組低(P<0.05)，而losartan治療組腎臟AT<,2>R mRNA水平較C組和DM組均增加.由以上

17、結(jié)果表明，在給予losartan(20mg/kg/d)后，ATIR被阻斷，而AT2R上調(diào)，從而使RnR表達進一步降低，這可能是losartan對糖尿病腎病產(chǎn)生治療效果的機制之一。 綜上所述，本研究結(jié)果提示：在體外培養(yǎng)的腎小球系膜細胞中存在RnR，RnR對系膜細胞具有促細胞增殖和促纖維化的作用；Ang Ⅱ和高葡萄糖可通過AT<,2>R調(diào)控RnR表達，使RnR的表達降低；在正常大鼠中，腎臟存在RnR；在STZ誘導的糖尿病大鼠，腎臟中