淫羊藿黃酮的分離鑒定及其抗骨質(zhì)疏松活性的機(jī)制探討.pdf

1、傳統(tǒng)中藥淫羊藿由于其豐富的藥用植物資源、多樣的藥理作用和確切的臨床療效而備受關(guān)注，一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。為了更好地開發(fā)利用這一資源，我們?cè)O(shè)計(jì)并開展了以下實(shí)驗(yàn)：(1) 以小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞為模型，采用四甲基偶氮唑藍(lán)法、堿性磷酸酶比活性測(cè)定方法，在細(xì)胞水平篩查了淫羊藿抗骨質(zhì)疏松的有效極性部位；(2) 利用硅膠和凝膠柱層析分離淫羊藿有效部位中的單體成分，根據(jù)化合物光譜數(shù)據(jù)(ESI-MS，<'1>HNMR和<'13>CNMR)鑒定其結(jié)構(gòu)；(3)

2、 以小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞為模型，采用四甲基偶氮唑藍(lán)法、堿性磷酸酶比活性測(cè)定、茜素紅染色及定量測(cè)定和油紅O染色及定量測(cè)定等方法，在細(xì)胞水平研究了淫羊藿有效部位和其中分離出的主要單體淫羊藿苷，以及淫羊藿苷代謝產(chǎn)物寶藿苷I對(duì)小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖、成骨和成脂分化的影響；(4) 以小鼠成骨細(xì)胞為模型，采用四甲基偶氮唑藍(lán)法、油紅O染色及定量測(cè)定等方法，在細(xì)胞水平研究了淫羊藿有效部位、淫羊藿苷及寶藿苷I對(duì)小鼠成骨細(xì)胞增殖及橫向分化的影響；(5) 采用蛋白

3、印跡和熒光定量PCR等方法，在分子水平對(duì)淫羊藿苷在骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨和成脂分化途徑中可能的作用靶點(diǎn)和作用途徑進(jìn)行了研究；(6) 采用MTT法和DPPH法測(cè)定6個(gè)淫羊藿黃酮對(duì)前破骨細(xì)胞株RAW264.7增殖的影響以及它們的細(xì)胞毒性和抗氧化清除自由基的能力。 研究結(jié)果表明： (1) 淫羊藿促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的有效部位是乙酸乙酯萃取部位和水提物； (2) 從淫羊藿藥材乙酸乙酯萃取部位中分離鑒定的6個(gè)黃酮

4、類成分，分別為淫羊藿苷(I)，寶藿苷Ⅱ(Ⅱ)，朝藿素B(Ⅲ)，寶藿苷I(Ⅳ)，金絲桃苷(v)和木犀草素(Ⅵ)； (3) 細(xì)胞水平上淫羊藿乙酸乙酯萃取部位可以促進(jìn)小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化而不抑制其向脂肪細(xì)胞分化。乙酸乙酯萃取物中主要成分淫羊藿苷及其代謝產(chǎn)物寶藿苷I，在一定濃度范圍內(nèi)，可以促進(jìn)小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化并抑制其成脂分化，此作用與化合物結(jié)構(gòu)、濃度及作用時(shí)間均有關(guān)，尤以10<'-9>和10<'-8>Smol／L的淫

5、羊藿苷在第14d的效果最好； (4) 細(xì)胞水平上，在一定濃度范圍內(nèi)，乙酸乙酯萃取部位、淫羊藿苷及寶藿苷I可以抑制小鼠成骨細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的橫向分化，以10<'-9>和10<'-8>mol/L。的淫羊藿苷在第6d的效果最好； (5) 淫羊藿苷可能通過對(duì)ERa蛋白表達(dá)的作用影響小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化和成脂分化。以上結(jié)果說明淫羊藿苷作為淫羊藿抗骨質(zhì)疏松的有效成分，在合適的濃度和作用時(shí)間下，可以雙向調(diào)節(jié)骨髓基質(zhì)細(xì)胞的成骨和成

6、脂分化，同時(shí)抑制成骨細(xì)胞的成脂橫向分化：一方面通過增加成骨細(xì)胞的數(shù)量而直接促進(jìn)骨形成，另一方面通過減少脂肪細(xì)胞的數(shù)量而間接促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞成骨分化并降低脂肪細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞的促進(jìn)作用，從而在整體水平上使骨量增加，達(dá)到防治骨質(zhì)疏松的作用，而ERa則是淫羊藿苷發(fā)揮作用的可能靶點(diǎn)之一。 (6) 另外，其他生物活性篩查實(shí)驗(yàn)表明：淫羊藿黃酮類化合物對(duì)前體破骨細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞的生長是促進(jìn)還是抑制依賴于其自身的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及作用濃度。