續(xù)斷抗絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景：
　　原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥是以骨量減少、骨的微結(jié)構(gòu)退化為特征的，致使骨的脆性增加以及易于發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病。在原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥中，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(PMO)占有很大比例。原發(fā)性骨質(zhì)疏松是一個全球性的健康問題，在我國骨質(zhì)疏松癥患者數(shù)達(dá)9000萬，約占總?cè)丝诘?％，其中50歲以上婦女發(fā)病率高達(dá)50％；美國國家骨質(zhì)疏松癥基金會最新數(shù)據(jù)顯示，在美國有1000萬人已經(jīng)罹患骨質(zhì)疏松癥，同時還有3400萬人正面臨骨丟失而致骨質(zhì)疏

2、松的威脅。骨質(zhì)疏松癥的并發(fā)癥相當(dāng)嚴(yán)重，極大地影響了患者的生活質(zhì)量。骨質(zhì)疏松癥相關(guān)性骨折不但發(fā)生率高，而且后果十分嚴(yán)重，甚至引起患者死亡；骨質(zhì)疏松癥的治療和康復(fù)需要耗費(fèi)大量的經(jīng)濟(jì)和衛(wèi)生資源，給家庭和社會造成極大負(fù)擔(dān)。長期以來，PMO的預(yù)防和治療采用以雌激素和孕激素為主的激素替代療法(HRT)；但是多項(xiàng)大規(guī)模臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，HRT的長期應(yīng)用具有增加患者的心血管意外事件和生殖系統(tǒng)腫瘤發(fā)生的風(fēng)險，某些試驗(yàn)甚至因此而叫停，嚴(yán)重限制了HRT在PM

3、O預(yù)防和治療中的應(yīng)用。針對HRT副作用開發(fā)的選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERMs)引起醫(yī)療工作者和患者的關(guān)注，此類藥物在發(fā)揮骨保護(hù)作用的同時對生殖系統(tǒng)刺激很小，心血管意外和生殖系統(tǒng)腫瘤發(fā)生風(fēng)險降低，有些還可以用來治療某些腫瘤；也存在消化道不良反應(yīng)和增加深靜脈血栓發(fā)生率等危險。其它新的抗骨質(zhì)疏松藥物，如二膦酸鹽類、鮭魚降鈣素(CT)和重組人甲狀旁腺素(rhPTH)等，臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，具有確切的PMO預(yù)防或者治療作用；但同樣存在諸多缺點(diǎn)。因

4、此，發(fā)掘更加安全、有效、經(jīng)濟(jì)的PMO防治藥物，引起了全世界的廣泛關(guān)注。中藥在治療骨質(zhì)疏松癥方面具有整體治療及副作用小等優(yōu)點(diǎn)，受到國內(nèi)外廣泛關(guān)注。此外，中藥資源豐富、價格低廉，更適合我國的國情。
　　研究目的：
　　本課題的目的旨在本實(shí)驗(yàn)室中藥黃酮抗骨質(zhì)疏松研究的基礎(chǔ)上，對中醫(yī)骨科臨床常用藥物續(xù)斷的抗絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥作用進(jìn)行系統(tǒng)深入的研究，發(fā)掘、分離得到重要活性成分—續(xù)斷總皂苷；在體外原代培養(yǎng)成骨細(xì)胞模型上闡明續(xù)斷防治絕經(jīng)后骨

5、質(zhì)疏松癥的物質(zhì)基礎(chǔ)及其機(jī)制。為續(xù)斷的深入研究提供理論依據(jù)，為天然活性產(chǎn)物防治骨丟失、骨質(zhì)疏松癥提供新線索。
　　研究方法：
　　1.本課題采用3月齡Sprague-Dawley大鼠，以模擬手術(shù)作為對照，行雙側(cè)卵巢切除術(shù)(OVX)建立大鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型，以雌二醇為陽性對照藥物，考察續(xù)斷提取物對去卵巢引起的大鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的防治效果。OVX術(shù)后4周將動物隨機(jī)分組，分別給予續(xù)斷提取物100，300，500mg/kg/d和

6、17β-雌二醇25μg/kg/d進(jìn)行灌胃治療。給藥16周收集大鼠24h尿液，麻醉動物采集血清，處死動物取子宮、心臟、肝臟、脾、肺、腎、胸腺、腦和左右股骨等樣本，臟器稱重計(jì)算臟器系數(shù)，對子宮進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。采用全自動生化分析儀對大鼠血清和尿液中的Ca、P和ALP等骨代謝指標(biāo)及肝腎功能指標(biāo)進(jìn)行分析；采用ELISA等免疫學(xué)方法對骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)尿DPD和血清OCN進(jìn)行測定；采用MTS材料測試系統(tǒng)對大鼠股骨生物力學(xué)特性進(jìn)行分析，采用骨密度儀及Mi

7、croCT對股骨的BMD、BMC及干骺端骨小梁微結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。
　　2.60％乙醇回流提取續(xù)斷總皂苷，D101型大孔樹脂對續(xù)斷總皂苷進(jìn)行分離純化，以續(xù)斷皂苷Ⅵ作為對照品，采用比色法進(jìn)行分析。
　　3.采用酶消化法分離得到大鼠原代成骨細(xì)胞，并從形態(tài)、組織化學(xué)及功能學(xué)等方面對細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　4.采用MTT、茜素紅染色等方法，觀察續(xù)斷總皂苷對大鼠原代成骨細(xì)胞的增殖、分化及礦化過程的影響；采用RT-PCR的方法對續(xù)斷總皂苷

8、對大鼠原代成骨細(xì)胞OPG和RANKLmRNA表達(dá)的影響進(jìn)行分析。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.續(xù)斷提取物可劑量依賴性地抑制OVX引起的大鼠體重增加；降低OVX所致的大鼠尿Ca、P的升高；降低骨轉(zhuǎn)換指標(biāo)ALP、OCN和DPD的含量，減慢骨轉(zhuǎn)換率；續(xù)斷提取物還可以增加大鼠股骨BMD，改善其生物力學(xué)特性中的骨應(yīng)力和彈性模量等內(nèi)在特性；同時可以改善大鼠股骨干骺端骨小梁的微結(jié)構(gòu)，包括增加骨組織容量，增加骨小梁的數(shù)量、厚度以及連接密度，降低

9、骨小梁間隙和SMI指數(shù)。長期應(yīng)用續(xù)斷提取物進(jìn)行治療未觀察到子宮刺激作用，對其它臟器和肝腎功能亦未產(chǎn)生明顯影響。
　　2.成功分離純化得到續(xù)斷總皂苷，純度為76.5％。
　　3.成功分離得到大鼠原代成骨細(xì)胞，鑒定結(jié)果顯示，該細(xì)胞具有成骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和功能學(xué)特性。
　　4.續(xù)斷總皂苷可劑量依賴性地促進(jìn)大鼠原代成骨細(xì)胞的增殖，促進(jìn)率可達(dá)180％；可劑量依賴性地提高大鼠原代成骨細(xì)胞ALP活性，最多可達(dá)2.5倍；還可增

10、加大鼠原代成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的形成。
　　5.續(xù)斷皂苷可劑量依賴性地調(diào)節(jié)大鼠原代成骨細(xì)胞OPG和RANKL基因表達(dá)，增加兩者mRNA表達(dá)水平的比值達(dá)8倍以上。
　　結(jié)論：
　　1.續(xù)斷對大鼠OVX所致絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥具有明顯的防治作用，能對抗去勢引起的大鼠體重增加，減少骨丟失、保持骨礦密度、增加骨強(qiáng)度、防止骨折發(fā)生，與雌激素相比較具有無子宮刺激的優(yōu)點(diǎn)。
　　2.續(xù)斷總皂苷能劑量依賴性地促進(jìn)大鼠原代培養(yǎng)成骨細(xì)胞的增殖

11、、分化及成熟。這是續(xù)斷防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是其抗骨質(zhì)疏松癥的細(xì)胞學(xué)機(jī)制。
　　3.續(xù)斷總皂苷劑量依賴性地提高大鼠原代成骨細(xì)胞OPG/RANKLmRNA表達(dá)水平的比值，表明續(xù)斷總皂苷可能通過調(diào)節(jié)OPG/RANKL表達(dá)對破骨過程產(chǎn)生影響。
　　4.本研究揭示了中藥續(xù)斷防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的作用及其機(jī)制，為續(xù)斷的臨床應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)；發(fā)現(xiàn)續(xù)斷皂苷防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松作用，證明續(xù)斷皂苷抗骨質(zhì)疏松作用可能與其促進(jìn)成骨細(xì)胞