藏紅花素對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松治療作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景：
　　骨質(zhì)疏松（Osteoporosis，OP）是一種全身性的骨骼退行性病變，以骨量減少和骨顯微結(jié)構(gòu)退變?yōu)橹饕卣?，引起骨脆性提高，骨?qiáng)度下降，骨折風(fēng)險增加。骨質(zhì)疏松發(fā)病率高，并發(fā)癥嚴(yán)重，資源消耗大，給患者本人及家庭和社會造成沉重負(fù)擔(dān)，已成為全球性的健康問題。其中，中老年女性由于骨量峰值較低和絕經(jīng)后雌激素水平顯著下降，很容易發(fā)生絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松（Postmenopausal Osteoporosis，PMO）。目前臨床上應(yīng)

2、用的抗骨質(zhì)疏松藥物，雖然可以取得一定療效，但是均屬替代治療，且費(fèi)用昂貴，對于龐大的患病人群，尤其是發(fā)展中國家，是一筆沉重的負(fù)擔(dān)，長期用藥還會造成患者依從性差，藥物不良反應(yīng)的發(fā)生率增加。因此，研發(fā)新的更加經(jīng)濟(jì)、安全、有效的抗骨質(zhì)疏松藥物已成為當(dāng)前醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域最活躍的課題之一。中藥在治療骨質(zhì)疏松方面，具有整體調(diào)節(jié)、毒副作用小、價格低廉等優(yōu)點(diǎn)，已引起國內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。其中據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，中藥藏紅花（Crocus Sativus）可能通過抗氧

3、化、抗炎途徑，具有潛在的抗骨質(zhì)疏松作用。
　　研究目的：
　　研究中藥藏紅花主要單體成分藏紅花素（Crocin）對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松模型的影響和對體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞增殖、分化和凋亡的作用，并探討其機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　研究方法：
　　1、動物實(shí)驗(yàn)：采用去勢大鼠建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型。將60只3月齡SD雌性大鼠隨機(jī)分為6組（n=10）：假手術(shù)組（Sham）、模型組（OVX+生理鹽水）、雌激素組（O

4、VX+雌二醇，25ug/kg/d）、藏紅花素低劑量組（OVX+Crocin，5mg/kg/d）、中劑量組（OVX+Crocin,10mg/kg/d）、高劑量組（OVX+Crocin，20mg/kg/d）。術(shù)后4周開始連續(xù)灌胃，持續(xù)給藥16周后處死大鼠，獲得大鼠血清、尿液、股骨及椎體標(biāo)本，稱取子宮濕重，計(jì)算子宮指數(shù)（Index of Uterus，IU）。然后通過雙能X線吸收骨密度儀（Dual Energy X Ray Absorptio

5、metry，DEXA）測定腰四（L4）椎體和股骨骨密度（Bone Mineral Density，BMD）；將股骨置于生物力學(xué)實(shí)驗(yàn)機(jī)（MTS858 Mini Bionix II）進(jìn)行三點(diǎn)彎曲實(shí)驗(yàn)，通過載荷-位移曲線計(jì)算出生物力學(xué)參數(shù)；應(yīng)用顯微 CT（Micro-CT，GE Healthcare，USA）掃描L4椎體，評價骨小梁顯微結(jié)構(gòu)；采用全自動生化分析儀（Ciba-Corning550，USA）測量血鈣、血磷、堿性磷酸酶（ALP）、骨

6、鈣蛋白（OC）、尿鈣、尿磷、尿肌酐值；使用黃嘌呤氧化酶（XO）法和硫代巴比妥酸（TBA）法測定血清中超氧化物歧化酶（SOD）活性與丙二醛（MDA）含量。
　　2、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：采用“胰酶消化+骨組織塊貼壁法”體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞，通過堿性磷酸酶染色和茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色對成骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定，傳代培養(yǎng)至第3代成骨細(xì)胞后，開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)：
　?。?）細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：將第3代細(xì)胞隨機(jī)分為4組：對照組、藏紅花素低劑量組（1mmol/L）、中劑

7、量組（2mmol/L）、高劑量組（4mmol/L）。采用噻唑藍(lán)比色法（MTT）檢測細(xì)胞增殖情況，應(yīng)用硝基苯磷酸（PNPP）法檢測細(xì)胞裂解液中ALP的活性。
　?。?）細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：將第3代細(xì)胞隨機(jī)分為5組：對照組；TNF-α組（30ng/ml）；藏紅花素低劑量組（1mmol/L）+TNF-α；中劑量組（2mmol/L）+TNF-α；高劑量組（4mmol/L）+TNF-α。24小時后利用分光光度法測定細(xì)胞裂解液中的凋亡相關(guān)酶Casp

8、ase-3的酶活性，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，使用黃嘌呤氧化酶（XO）法和硫代巴比妥酸（TBA）法測定細(xì)胞裂解液中SOD活性與MDA含量。
　　研究結(jié)果：
　　1、動物實(shí)驗(yàn)：與OVX組相比，藏紅花素治療組椎體和股骨骨密度下降的趨勢得到有效抑制（P<0.05）；股骨三點(diǎn)彎曲最大載荷、最大應(yīng)力、楊氏模量均顯著增高（P<0.05）；L4椎體松質(zhì)骨骨小梁顯微結(jié)構(gòu)明顯改善（P<0.05）；骨生化指標(biāo)血清ALP、血清 OC、尿鈣/肌

9、酐、尿磷/肌酐測定值明顯下降（P<0.05）；藏紅花素有助于提高OVX大鼠血清SOD活性（P<0.05），降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量（P<0.05）。
　　2、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：經(jīng)細(xì)胞鑒定，本實(shí)驗(yàn)方法能夠培養(yǎng)出純度較高、滿足實(shí)驗(yàn)要求的成骨細(xì)胞。
　?。?）細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：與對照組相比較，藏紅花素中、高劑量可提高成骨細(xì)胞增殖率（P<0.05），提高ALP活性（P<0.05）；
　　（2）細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：與TNF-α組相比，藏紅花素

10、中、高劑量組能夠有效抑制凋亡關(guān)鍵酶Caspase-3活性（P<0.05），降低細(xì)胞凋亡率（P<0.05）；能夠提高細(xì)胞裂解液中SOD活性（P<0.05），降低MDA含量（P<0.05）。
　　研究結(jié)論：
　　藏紅花素能夠抑制去卵巢大鼠骨量丟失，提高骨生物力學(xué)強(qiáng)度，改善松質(zhì)骨骨小梁顯微結(jié)構(gòu)，改善骨代謝，降低骨轉(zhuǎn)換率；可以促進(jìn)體外培養(yǎng)大鼠成骨細(xì)胞的增殖，抑制TNF-α誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡。藏紅花素對骨質(zhì)疏松具有一定的治療作用，其作