前列腺癌患者組織和尿液DD3 mRNA的定量檢測及其初步臨床應用.pdf

1、目的 采用Taqman-MGB探針技術，建立熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應(FQ-RT-PCR)檢測DD3mRNA的方法，對前列腺癌患者組織和尿液中DD3mRNA進行定量檢測并對其臨床應用進行評價。 方法 1．根據Genebank的DD3mRNA序列，在DD3基因的外顯子l和3之間設計一對引物和一條Taqman-MGB探針，優(yōu)化反應體系，建立DD3mRNA的FQ-RT-PCR方法。 2．用pBluescrip

2、tIISK載體與普通PCR擴增所得的DD3eDNA片段進行連接，構建重組質粒作為標準品。 3．對本方法進行方法學評價，包括探針穩(wěn)定性、靈敏度、特異度和精密度等等。 4．收集前列腺癌患者組織和尿液標本，檢測DD3mRNA含量并進行臨床應用評價。 結果 1．成功建立了熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應檢測DD3mRNA的方法，本方法檢測靈敏度為6拷貝／反應，線性范圍為6～6×108拷貝／反應，Ct值與拷貝數之間具有良

3、好的線性關系，相關系數為0．994。批內、批間變異系數分別為1．25～2．06％和2．32-3．59％。擴增產物克隆和測序分析顯示本擴增片段為DD3特異性片段。2．27例非前列腺組織中DD3mRNA的含量均小于本方法最低檢測限，而21例前列腺癌(PCa)組織、35例良性前列腺增生(BPH)組織和14例正常前列腺組織均可檢測到DD3mRNA的表達。PCa較BPH和正常前列腺組織DD3mRNA表達量顯著增高，而后兩組間則無顯著性差異(P>0

4、．05)。經ROC曲線分析，ROC-AUC=0．937(95％Ch0．879～0．995)。前列腺組織DD3mRNA含量以1．4x105拷貝／mg組織為臨界值時，靈敏度、特異度、準確度、陽性預測值、陰性預測值、分別為90．5％、94．3％、92．3％、90．5％和94．3％。前列腺組織DD3表達量與臨床分期和分化程度之間均無明顯相關性。 3．在前列腺穿刺活檢前共收集21例PCa和40例BPH患者前列腺按摩后的尿液。由于尿沉渣中不

5、僅含有PCa細胞和非前列腺細胞，還含有尿道上皮細胞，而PSAmRNA在正常前列腺細胞中表達相對恒定，在PCa細胞中的表達有輕度下降(～1．5倍)，所以用PSAmRNA校正尿沉渣中的前列腺細胞(PSAmRNA的檢測方法學已建立)。尿液PSAmRNA表達呈陽性的標本才被認為含有足夠的前列腺細胞，方可用于DD3mRNA的檢測。尿液DD3mRNA含量以DD3mRNA／PSAmRNA的比值表示。PCa組尿液DD3mRNA含量明顯高于BPH組，差異

6、具有統計學意義(P<0．05)。尿液DD3mRNA的陽性率與臨床分期和病理分級無關。尿液DD3mRNA的ROC曲線分析結果顯示，ROC-AUC=0．705f95％Ch0．578～0．832)。尿液DD3mRNA即DD3mRNA／PSAmRNA的比值以0．¨6為臨界值時，尿液DD3mRNA診斷PCa的總體靈敏度和特異度為66．7％和80．0％。如果血清PSA以l0ng／ml為臨界值，則血清PSA的總體特異度為50．0％(20／40)，尿液

7、DD3mRNA較血清PSA具有更高的特異性。此外血清PSA小于4ng／ml和血清PSA位于4～10ng／ml之間的PCa患者各1例，其尿液DD3mRNA均為陽性，這提示尿液DD3mRNA檢測可能有助于檢出低血清PSA的PCa患者。 結論 1．成功建立了熒光實時定量逆轉錄聚合酶鏈反應檢測DD3mRNA的方法，本方法具有敏感、特異、準確、高效、重復性好、結果數據化等特點。 2．PCa組織中DD3mRNA特異性高表達，