前列腺癌患者組織和尿液DD3 mRNA的定量檢測及其初步臨床應(yīng)用.pdf

1、目的 采用Taqman-MGB探針技術(shù)，建立熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-RT-PCR)檢測DD3mRNA的方法，對前列腺癌患者組織和尿液中DD3mRNA進(jìn)行定量檢測并對其臨床應(yīng)用進(jìn)行評價。 方法 1．根據(jù)Genebank的DD3mRNA序列，在DD3基因的外顯子l和3之間設(shè)計一對引物和一條Taqman-MGB探針，優(yōu)化反應(yīng)體系，建立DD3mRNA的FQ-RT-PCR方法。 2．用pBluescrip

2、tIISK載體與普通PCR擴(kuò)增所得的DD3eDNA片段進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品。 3．對本方法進(jìn)行方法學(xué)評價，包括探針穩(wěn)定性、靈敏度、特異度和精密度等等。 4．收集前列腺癌患者組織和尿液標(biāo)本，檢測DD3mRNA含量并進(jìn)行臨床應(yīng)用評價。 結(jié)果 1．成功建立了熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測DD3mRNA的方法，本方法檢測靈敏度為6拷貝／反應(yīng)，線性范圍為6～6×108拷貝／反應(yīng)，Ct值與拷貝數(shù)之間具有良

3、好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0．994。批內(nèi)、批間變異系數(shù)分別為1．25～2．06％和2．32-3．59％。擴(kuò)增產(chǎn)物克隆和測序分析顯示本擴(kuò)增片段為DD3特異性片段。2．27例非前列腺組織中DD3mRNA的含量均小于本方法最低檢測限，而21例前列腺癌(PCa)組織、35例良性前列腺增生(BPH)組織和14例正常前列腺組織均可檢測到DD3mRNA的表達(dá)。PCa較BPH和正常前列腺組織DD3mRNA表達(dá)量顯著增高，而后兩組間則無顯著性差異(P>0

4、．05)。經(jīng)ROC曲線分析，ROC-AUC=0．937(95％Ch0．879～0．995)。前列腺組織DD3mRNA含量以1．4x105拷貝／mg組織為臨界值時，靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、分別為90．5％、94．3％、92．3％、90．5％和94．3％。前列腺組織DD3表達(dá)量與臨床分期和分化程度之間均無明顯相關(guān)性。 3．在前列腺穿刺活檢前共收集21例PCa和40例BPH患者前列腺按摩后的尿液。由于尿沉渣中不

5、僅含有PCa細(xì)胞和非前列腺細(xì)胞，還含有尿道上皮細(xì)胞，而PSAmRNA在正常前列腺細(xì)胞中表達(dá)相對恒定，在PCa細(xì)胞中的表達(dá)有輕度下降(～1．5倍)，所以用PSAmRNA校正尿沉渣中的前列腺細(xì)胞(PSAmRNA的檢測方法學(xué)已建立)。尿液PSAmRNA表達(dá)呈陽性的標(biāo)本才被認(rèn)為含有足夠的前列腺細(xì)胞，方可用于DD3mRNA的檢測。尿液DD3mRNA含量以DD3mRNA／PSAmRNA的比值表示。PCa組尿液DD3mRNA含量明顯高于BPH組，差異

6、具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．05)。尿液DD3mRNA的陽性率與臨床分期和病理分級無關(guān)。尿液DD3mRNA的ROC曲線分析結(jié)果顯示，ROC-AUC=0．705f95％Ch0．578～0．832)。尿液DD3mRNA即DD3mRNA／PSAmRNA的比值以0．¨6為臨界值時，尿液DD3mRNA診斷PCa的總體靈敏度和特異度為66．7％和80．0％。如果血清PSA以l0ng／ml為臨界值，則血清PSA的總體特異度為50．0％(20／40)，尿液

7、DD3mRNA較血清PSA具有更高的特異性。此外血清PSA小于4ng／ml和血清PSA位于4～10ng／ml之間的PCa患者各1例，其尿液DD3mRNA均為陽性，這提示尿液DD3mRNA檢測可能有助于檢出低血清PSA的PCa患者。 結(jié)論 1．成功建立了熒光實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測DD3mRNA的方法，本方法具有敏感、特異、準(zhǔn)確、高效、重復(fù)性好、結(jié)果數(shù)據(jù)化等特點。 2．PCa組織中DD3mRNA特異性高表達(dá)，