前列腺癌患者組織和尿液端粒酶hTERT mRNA的定量檢測及其初步臨床應用.pdf

1、目的：采用Taqman探針技術(shù),建立熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(FQ-RT-PCR)檢測端粒酶hTERT mENA的方法,對前列腺癌患者組織和尿液中端粒酶hTEIRTmRNA進行定量檢測并對其臨床應用進行評價. 方法：1.根據(jù)端粒酶hTERT mRNA全序列(NM198253),在端粒酶hTERT基因的外顯子2和3之間設(shè)計一對引物和一條Taqman探針,優(yōu)化反應體系,建立端粒酶hTERT mRNA的FQ-RT-PCR方法.2.用

2、pMD18-T載體與普通PCR擴增所得的端粒酶hTERT cDNA片段進行連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒作為標準品,將標準品10倍倍比稀釋后進行熒光定量PCR擴增,以拷貝數(shù)的自然對數(shù)為橫坐標,循環(huán)域值(Ct)為縱坐標制作標準曲線.3.對本方法進行方法學評價,包括探針穩(wěn)定性、靈敏度、特異度和精密度等等.4.用熒光定量RT-PCR對26例前列腺癌患者(PCa)組織和30例前列腺增生患者(BPH)組織,18例前列腺癌患者(PCa)的尿液和27例前列腺增生

3、患者(BPH)的尿液標本,分別檢測端粒酶hTERT mRNA含量并進行臨床應用評價.結(jié)果1.成功建立了實時熒光定量RT-PCR檢測端粒酶hTERT mRNA的方法,本方法靈敏度高,可達10 copies/reaction,線形范圍廣,達10～1×10<'8>copies/reaction,重復性好,批內(nèi)CV:1.25﹪～2.06﹪,批間CV:3.32﹪～4.59﹪,Ct值與拷貝數(shù)之間具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)為0.997.擴增產(chǎn)物克隆

4、和測序分析顯示本擴增片段為端粒酶hTERT特異性片段.2.30例良性前列腺增生(BPH)組織中端粒酶均未檢測到hTERT mRNA的表達,而26例前列腺癌(PCa.)組織中有19例檢出(73.0﹪)hTERT mRNA表達陽性,PCa組含量(hTERT mRNA/GAPDHmRNA×10<'5>):9.64(0.00～20.81).hTERT mRNA在PCa組織中表達量顯著高于BPH組織(P<0.01).ROC曲線分析結(jié)果顯示ROC-

5、AUC=0.865(95﹪Cl:0.758～0.973),當hTERT mRNA/GAPDH mRNA×10<'5>截斷值為0.875時,其敏感度達73.0﹪、特異度100﹪.從表達趨勢上看端粒酶hTERTmRNA在病理分化程度越差表達量越高,但尚不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05),在不同臨床分期表達量也不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05).3.在前列腺穿刺活檢前共收集18例前列腺癌(PCa)和27例前列腺增生(BPH)患者前列腺按摩后的尿液

6、.由于尿沉渣中不僅含有PCa細胞和非前列腺細胞,還含有其它脫落細胞如膀胱上皮細胞、腎小管細胞、尿道上皮細胞等,所以不能用管家基因校正前列腺細胞數(shù),PSA mRNA在正常前列腺細胞中表達相對恒定,在PCa細胞中的表達有輕度下降(～1.5倍),所以用PSAmRNA校正尿沉渣中的前列腺細胞(PSAmRNA的檢測方法學已建立),尿液PSA mRNA表達呈陽性(Ct值<37個循環(huán))的標本才被認為含有足夠的前列腺細胞,方可用于端粒酶hTERT、mT

7、NA的檢測.尿液端粒酶hTERT mRNA含量以端粒酶hTERT mRNA/PSA mRNA的比值乘以10<'4>來表示。 結(jié)果：PCa組(medianO,rarlge:0～0.728),BPH組(median,0;range:0～0)表達均為陰性,兩者相比具有顯著性差異(U=180.0,W=558.0,Z=-2.19,P<0.05).尿液端粒酶hTERT、mRNA的陽性率與臨床分期和病理分級無關(guān).分析實驗結(jié)果顯示,ROC曲線下

8、面積(AUC-ROC)=0.630:(95﹪CI:0.456～0.803), 18例癌標本中有6例檢出hTERT mRNA陽性,27例BPH組中2例檢出陽性,其檢測敏感度達33.3﹪,特異度92.6﹪,陽性預測值(PPV)75.0﹪,陰性預測值(NPV)67.5﹪,雖敏感度不高,但有很高的特異度.臨床最常用篩查PCa的指標是血清PSA,雖有較高的敏感度,但特異度不高,在非惡性前列腺疾病時也會升高,而尿液hTERTmRNA敏感度低,但特異

9、度高,在PCa篩查時可以將兩者相結(jié)合,進一步提高診斷效能. 結(jié)論：1.成功建立了熒光實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應檢測端粒酶hTERT mRNA的方法,本方法具有敏感、特異、準確、高效、重復性好、結(jié)果數(shù)據(jù)化等特點.2.PCa組織中端粒酶hTERTmTNA特異性高表達,為端粒酶hTERr.mRNA成為PCa診斷和監(jiān)測指標提供了理論依據(jù).3.尿液端粒酶h17ERT mRNA用于PCa診斷較血清PSA存在敏感度不高,但有更高的特異性,在P