2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性進(jìn)行性自身免疫性疾病,以關(guān)節(jié)滑膜炎及對稱性關(guān)節(jié)骨、軟骨破壞為主要特征。目前,RA的病因及發(fā)病機(jī)制仍尚未清楚,但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)天然免疫在RA的發(fā)病和病情進(jìn)展中起重要作用。Toll-like receptors(TLRs)是一組介導(dǎo)天然免疫反應(yīng)的受體分子,它通過識別病原相關(guān)分子模式(Pathogen-Associated Molecular Patterns,PA

2、MPs)及某些內(nèi)源性配體,引發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并導(dǎo)致炎癥介質(zhì)的釋放,最終激活獲得性免疫。迄今為止,人類已發(fā)現(xiàn)11個Toll樣受體家族成員(TLR1-11),其中,TLR2被認(rèn)為與RA發(fā)病關(guān)系最為密切。TLR2的高表達(dá)是導(dǎo)致RA炎癥反應(yīng)和病情加重的因素之一,但其具體表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不明確。
  流行病學(xué)調(diào)查顯示,RA在女性發(fā)病多于男性,特別是在55歲以下的RA患者中,女性的發(fā)病率明顯高于男性,是男性的4~5倍。同時女性患者病情的嚴(yán)重程度受妊娠

3、、分娩以及月經(jīng)周期的影響。已有研究表明,雌激素在RA的發(fā)病中可能起著很重要的作用。
  雌激素和TLR2都是與RA發(fā)病相關(guān)的重要因子,但是,迄今尚無有關(guān)雌激素對TLR2基因表達(dá)調(diào)控作用的報道。本研究以17β-雌二醇(E2)為刺激因素,探討在體外類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎細(xì)胞模型中,雌激素對TLR2基因表達(dá)的影響及其作用機(jī)制,這不僅對深入了解TLR2基因功能有重要意義,而且將為闡明RA的發(fā)病機(jī)制提供重要的分子水平依據(jù)。
  材料與方法:<

4、br>  一、實驗材料
  1、人淋巴瘤白血病單核細(xì)胞系THP-1,人胚腎細(xì)胞系HEK293;
  2、刺激藥物:E2、PMA、IL-1β、ICI182,780、放線菌素D(actinomycin-D)和放線菌酮(cycloheximide);
  3、RNA提取相關(guān)試劑、RT試劑盒及Real-time PCR相關(guān)試劑;
  4、人類雌激素受體alpha(ERα)表達(dá)載體;
  5、Western印跡雜交相

5、關(guān)試劑
  6、基因克隆及螢光素酶報告基因檢測相關(guān)試劑
  7、電泳泳動遷移實驗(EMSA)、染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)相關(guān)試劑
  二、實驗方法
  1、炎性細(xì)胞模型的建立;
  2、Real-time PCR檢測E2等藥物刺激前后TLR2 mRNA表達(dá)水平的變化;
  3、Western blot檢測E2對TLR2蛋白表達(dá)水平的影響;
  4、構(gòu)建熒光素酶報告基因載體p403-1uc,轉(zhuǎn)染H

6、EK293細(xì)胞,雙熒光素酶活性檢測系統(tǒng)分析HEK293細(xì)胞中單獨轉(zhuǎn)染ERa,或單獨E2刺激,或轉(zhuǎn)染ERa同時以不同濃度E2刺激對TLR2基因啟動子活性的影響;
  5、利用生物信息學(xué)軟件分析TLR2基因啟動子結(jié)構(gòu),構(gòu)建TLR2啟動子序列系列截短的螢光素酶報告基因重組體,應(yīng)用雙熒光素酶活性檢測系統(tǒng)檢測啟動子的活性;
  6、雙熒光素酶活性檢測系統(tǒng)分析E2刺激前后TLR2啟動子活性的變化,鑒定TLR2啟動子關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)和雌激

7、素反應(yīng)區(qū);
  7、EMSA實驗鑒定TLR2啟動子內(nèi)激素反應(yīng)元件及E2對ERa與該反應(yīng)元件結(jié)合力的影響;
  8、ChIP實驗進(jìn)一步在體內(nèi)條件下驗證ERa與該位點的結(jié)合以及E2對這種結(jié)合的作用。
  結(jié)果:
  1、Real-time RT-PCR結(jié)果證明E2以濃度依賴方式上調(diào)TLR2 mRNA表達(dá)水平。
  2、Western印跡雜交顯示E2使THP-1細(xì)胞中TLR2蛋白水平顯著增加。
  3、Re

8、al-time RT-PCR結(jié)果顯示雌激素受體抑制劑ICI182,780和轉(zhuǎn)錄抑制劑actinomycin-D可分別抑制這種上調(diào),而蛋白合成抑制劑cycloheximide則否。
  4、TLR2基因啟動子報告基因p403-1uc轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,熒光素酶活性分析顯示E2呈ERa依賴和劑量依賴方式上調(diào)啟動子活性。
  5、生物信息學(xué)分析顯示TLR2基因啟動子區(qū)無TATA盒,存在ER、Sp(l)、AP-2a、及C/EBP等

9、多個潛在的轉(zhuǎn)錄因子作用元件;
  6、系列截短的TLR2基因啟動子報告基因熒光素酶活性分析提示-287~-230區(qū)域是該基因的雌激素反應(yīng)區(qū);
  7、EMSA和ChIP實驗分別在體外和體內(nèi)條件下證明了TLR2啟動子-251~-237區(qū)存在ER反應(yīng)元件;并且E2作用增強(qiáng)ER蛋白與這個位點的結(jié)合。
  結(jié)論:
  1、E2刺激可以上調(diào)TLR2基因mRNA和蛋白表達(dá)水平;
  2、TLR2基因啟動子-251~-2

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